Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn

Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vàogenome cây trồng. Công nghệ gen thực vật diễn biến nỗi bật qua các móc thờigian tạo ra những bước tiến ngày càng xa và khả năng ứng dụng cũng tăng theo
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giới thiệu 1. Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vàogenome cây trồng. Công nghệ gen thực vật diễn biến nỗi bật qua các móc thờigian tạo ra những bước tiến ngày càng xa và khả năng ứng dụng cũng tăng theo: Những phát triển quan trọng Năm Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ 1980 Agrobacterium tumefaciens Marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần thiết 1983 Biến nạp vào tế bào trần 1984 Kháng thuốc trừ cỏ 1985 1986 Kháng virus Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng 1987 Kháng côn trùng Biến nạp phi sinh học Điều khiển sự chín ở cà chua 1988 Kháng thể ở thực vật bậc cao 1989 Biến nạp phi sinh học ở ngô 1990 Tính bất dục đực nhân tạo Thay đổi thành phần carbohydrate 1991 Tạo alkaloid tốt hơn Thay đổi acid béo 1992 Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật 1994 Trên thế giới có 48 trong đó Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen 1998 được thị trường hóa Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha Cho đến nay khoảng 9000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được 1999 đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1360) Thành tựu kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp AND cho phépngười ta thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng ditruyền mới. Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với haiphương pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển nạp gen gián tiếp nhờ sự cải tiếnkhông ngừng hệ thống Ti-plasmid trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, và(2) chuyển gen trực tiếp theo phương pháp PEG (polyethylene glycol), phươngpháp vi tiêm (microinjection), phương pháp mỡ lỗ bằng điện (electroporation),phương pháp bắn gen (biolistic), phương pháp chuyển qua ống hạt phấn (pollentube pathway) và một và kỹ thuật khác. Trong đó ba phương pháp được ứng dụng rộng rãi là chuyển gen bằngAgrobacterium tumefaciens , tế bào trần và phi sinh học. 2. Chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, phátsinh ung thư, tạo ra kết quả trực tiếp hình thành khối u để tổng hợp ra một loạidinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Gen Agrobacterium là nhóm genus có tính chất sinh sản trong đất, gramâm, cùng họ với Rhizobium. Có bốn species đã được ghi nhận. Agrobacteriumtumefaciens tạo ra khối u trong tế bào tumor chưa được phân hóa và chưa đượctổ chức. một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không tạo khối u nhưngkích thích sự tăng trưởng của teratomas (thẻ dị thường, khác thường). tuy nhiênthực vật thuộc đơn tử diệp tỏ ra kháng đối với Agrobacterium, chỉ trừ một vàiloài của Asparagus. Đặc điểm quan trọng của tế bào khối u là tăng trưởng không cần kích tốthực vật trong môi trường nuôi cấy mô. Điều này ngược lại với tế bào cây bìnhthường, do cần phải bổ sung auxin, cytokinin để duy trì sự tăng trưởng và sựsống trong nuôi cấy. Sự tăng trưởng không phụ thuộc vào hormon của tế bàokhối u bị kích thích bởi Agrobacterium gợi cho chúng ta một ý tưởng: sẽ có sựthay đổi hàm lượng hormon nội sinh. Sự thay đổi mức biến dạng dị hình nàytrong cơ quan bi biến dạng dị hình được ghi nhận. Những khối u này là khônggian sống của vi khuẩn, một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩnđược tạo ra, đây cũng chính là đặc tính của tế bào khối u. Trong mô bình thườngkhông có hình thành nhóm hóa học này. Những opine phổ biến là nopalin vàoctopin.Về mặt hóa học opine là sản phẩm ngưng tụ của aminoacid vớicetoacide hoặc aminoacide với đường. Octopin được tạo nên từ amino acid làarginine và pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ arginine và -cetoglutaraldehyd.Công thức cấu tạo của opine được trình bày ở hình 1.1. Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử dụngtrong công nghiệp gen hiện đại. Để được quá trình này điều cần thiết là phảilàm rõ sự tương tác giữa Agrobacterium với thực vật. COOH COOH COOH COOH HC NH CH HC CH CH CH2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH NH NH C C H2N NH H2N NH Octopin Nopalin Hình 1.1 Công thức cấu tạo của opine. 2.1 Ti – plasmid Chức năng của plasmid đã được ghi trên bản đồ là khả năng của nhiềudòng khác nhau. Agrobacterium tumefaciens kích thích tạo khối u để tổng hợpcác opine. Ti-plasmid thể hiện tính chất chuyên biệt đối với một opine nào đómà thôi. Thí dụ Ti-plasmid của dòng C58 Agrobacterium tumefaciens mã hóađối với nopaline và dị hóa nopaline nhưng không phân giải được octopine, nóđược xếp vào nhóm plasmid có dạng nopaline. Việc sử dụng A. tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta pháthiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị th ương,được gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.2). Trong những năm bảy mươi người tatìm thấy trong các chủng A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất l ...