CYTOKINE – Phần 2

Việc phân lập và tinh chế bằng phương pháp hoá sinh của các cytokine gặp phải một số trở ngại. Ðầu tiên là dịch nổi nuôi tế bào thường chứa hỗn hợp nhiều cytokine hơn là chứa một cytokine, điều này làm cho khó có thể qui một chức năng nào đó cho một chất riêng biệt. Cùng với khó khăn này còn có một khó khăn khác là các hệ thống ban đầu dùng để thử nghiệm cytokine gồm có các quần thể lympho bào không thuần nhất và sự đáp ứng của chúng với các cytokine được...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
CYTOKINE – Phần 2 CYTOKINE – Phần 2Tinh chế bằng phương pháp hoá sinhViệc phân lập và tinh chế bằng phương pháp hoá sinh của các cytokine gặp phảimột số trở ngại. Ðầu tiên là dịch nổi nuôi tế bào thường chứa hỗn hợp nhiềucytokine hơn là chứa một cytokine, điều này làm cho khó có thể qui một chứcnăng nào đó cho một chất riêng biệt. Cùng với khó khăn này còn có một khó khănkhác là các hệ thống ban đầu dùng để thử nghiệm cytokine gồm có các quần thểlympho bào không thuần nhất và sự đáp ứng của chúng với các cytokine đ ược thửthường đưa đến các kết quả không rõ ràng. Một khó khăn tiếp theo nữa là dịch nổinuôi tế bào có một nồng độ cytokine rất thấp.Có hai phát minh đã cho phép các nhà nghiên cứu vượt qua được những khó khănnày và có thể xác định được các đặc trưng hoá sinh của các cytokine. Phát minhthứ nhất là sự phát hiện ra các dòng tế bào ung thư có khả năng tiết cytokine.Những dòng tế bào ung thư này đã cung cấp các quần thể tế bào thuần nhất có khảnăng tiết ra một cytokine nhất định với nồng độ cao hơn khi nuôi các tế bào dạnglympho này. Phát minh thứ hai là sự phát hiện ra các dòng tế bào mà sự sinhtrưởng của chúng phụ thuộc vào sự có mặt của một cytokine nhất định. Nhữngdòng tế bào này đã cung cấp một hệ thống thực nghiệm đơn giản, đó là một quầnthể tế bào thuần nhất có khả năng tăng sinh khi đáp ứng với một yếu tố sinhtrưởng nhất định.Khi sử dụng hệ thống thử nghiệm này để đánh giá hoạt tính sinh học của cáccytokine đã phát hiện từ trước có các chức năng khác nhau, người ta đã phát hiệnthấy rằng trước đây tưởng như có rất nhiều cytokine và mỗi một cytokine được đặttên theo hoạt tính sinh học của nó, nhưng thực ra đó lại chỉ là một cytokine có cáchoạt tính sinh học khác nhau. Vì vậy người ta đã đưa ra một bảng thuật ngữ chuẩntrong đó phần lớn các cytokine được gọi là interleukin dựa theo vai trò của nótrong việc truyền thông tin giữa các tế bào bạch cầu. Những interleukin đầu tiênđược phát hiện được gọi là interleukin-1 (IL-1) và interleukin-2 (IL-2). IL-1 cónhiều hoạt tính sinh học khác nhau mà trước đây đã được mô tả ít nhất là có 8 yếutố, IL-2 trước đây được phát hiện những hoạt tính và đặt tên cho 4 yếu tố khácnhau. Trong thập kỷ 80 người ta đã phát hiện được 10 interleukin và một sốcytokine khác còn vẫn được đặt tên theo hoạt tính sinh học của chúng. Sự tươngứng giữa các lymphokine đã được tinh chế và các yếu tố được đặt tên trước đây đãđược sắp xếp lại một cách rõ ràng (xem bảng 11.1). Kỹ thuật tinh chế cácinterleukin bằng phương pháp hoá sinh gồm có một số kỹ thuật tinh chế protein vàthường sử dụng nước nổi chứa cytokine khi nuôi các tế bào có khả năng sản xuấtmột cytokine nhất định với số lượng lớn. Ví dụ các dòng tế bào mono bị ung thưhoá được chọn lọc để sản xuất IL-1 và các dòng tế bào lymphoma thuộc loại tếbào T được chọn để sản xuất IL-2. Người ta nuôi các tế bào này trong các bìnhnuôi cấy lớn và dùng các chất kích thích phân bào, phorbon este hoặc các chấtkích thích thích hợp khác kích thích chúng để chúng sinh ra các cytokine. Sau đótiến hành tinh chế cytokine từ dịch nổi nuôi cấy. Trong phần lớn các trường hợpngười ta cô đặc cytokine bằng lọc màng và tiếp theo bằng kỹ thuật sắc ký trao đổiion, lọc gel, kỹ thuật tập trung đẳng điện và sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Sau mỗibước tinh chế người ta phải xác định lại mức độ hoạt tính sinh học của cytokine.Việc tinh chế IL-2 là một ví dụ điển hình. Thử nghiệm sinh học quyết định trongquá trình tinh chế này dựa vào khả năng kích thích tăng sinh của IL-2 đối với mộtsố tế bào nhất định. Thông thường dòng tế bào được dùng là dòng tế bào CTLL-2,đó là một dòng tế bào Tc của chuột nhắt có sinh trưởng phụ thuộc vào IL-2; tế bàoHT-1, đó là tế bào Th mà có sinh trưởng phụ thuộc vào IL-2. Sau mỗi bước táchphần tinh chế người ta cho phần tinh chế được vào các dòng tế bào và đánh giá sựtăng sinh của tế bào thông qua khả năng thâu nhận thymidine [3H]. Hiệu xuất tinhchế bằng phương pháp hoá sinh còn rất kém mặc dù các tế bào có thể sinh ra mộtlượng lớn interleukin. Ví dụ từ 10 lít nước nổi thu được từ nuôi cấy dòng tế bàoung thư chuột nhắt sản sinh ra IL-2 khi được kích thích bằng PHA thì người ta chỉthu được khoảng 50(g IL-2 mà thôi. Thường thì hiệu xuất của việc tinh chế bằngphương pháp hoá sinh là không cao và độ tinh khiết cũng không lớn trong hầu hếtcác trường hợp.Clone hoá các gene cytokineNgười ta có thể thu được khối lượng lớn cytokine tinh khiết khi sử dụng các kỹthuật tái tổ hợp ADN từ các gene mã hoá cytokine. Ngày nay người ta đã lập đượcmột kho ADN bổ cứu từ các dòng tế bào sản xuất cytokine thích hợp (xem hình2.4). Sau đó sàng lọc kho này bằng cách làm xuất hiện các clone ADN bổ cứutrong tế bào COS. Khi thử nghiệm các hoạt tính cytokine trong nước nổi nuôi cấytế bào COS người ta nhận ra những tế bào COS nào đã được nạp đoạn ADN bổcứu mã hoá cytokine. Có một kỹ ...