Đặc điểm trình tự nucleotide của gen Cystatin II phân lập từ mRNA của hai mẫu ngô địa phương Sơn La và Hà Giang

Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen cystatin II từ mRNA của hai mẫu ngô địa phương Sơn La (SL) và Hà Giang (HG). Gen cystatin II phân lập được có kích thước 405 bp, mã hoá 134 amino acid.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đặc điểm trình tự nucleotide của gen Cystatin II phân lập từ mRNA của hai mẫu ngô địa phương Sơn La và Hà GiangVì Thị Xuân Thủy và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ119(05): 101 - 106ĐẶC ĐIỂM TRÌNH TỰ NUCLEOTIDECYSTATIN II PHÂN LẬPTỪ mRNA CỦA HAI MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG SƠN LA VÀ HÀ GIANGVì Thị Xuân Thủy1*, Đặng Thị Hoa2,Nguyễn Vũ Thanh Thanh2, Chu Hoàng Mậu31Trường Đại học Tây Bắc, 2Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên,3Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái NguyênTÓM TẮTCysteine proteinase thực hiện chức năng trưởng thành protein, làm mới protein để phù hợp vớinhững thay đổi của môi trường và loại bỏ protein bất thường. Cystatin là một dạng protein ức chếhoạt động của cysteine proteinase, nó đóng vai trò như cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạtđộng của cysteine proteinase vì thế ngăn cản việc đi vào của cơ chất protein khác. Do đó, cystatincó mối liên quan đến khả năng chống vi sinh vật, chống côn trùng, trong đó có mọt gây hại củathực vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, tách dòng và xác định trìnhtự nucleotide của gen cystatin II từ mRNA của hai mẫu ngô địa phương Sơn La (SL) và Hà Giang(HG). Gen cystatin II phân lập được có kích thước 405 bp, mã hoá 134 amino acid. Có 9 vị trí38130,nhưng không có sự sai khác ở điểm gắn kết của vùng chức năng CY. Gen cystatin II đã phân lập đượcsử dụng để thiết kế vector chuyển gen nhằm cải thiện khả năng kháng mọt của cây ngô.Từ khóa: Cystatin, cysteine proteinase, gen cystatin II, mọt ngô, Zea maysMỞ ĐẦU*.Ở Việt Nam, ngô (Zea mays L.) là cây lươngthực quan trọng thứ hai saucysteine proteinase.[0, ngô lai rất dễ bị mọt xâm hại.Mọt ngô (Sitophilus zeamais. Trong bài.Sâu non nở trong hạt thường ă[4], [8].ở động vật, thực vật và vi sinh vật [2].Ở động vật không xương sống, cysteineproteinase là enzyme tiêu hóa [2], [9cysteine proteinasegen cystatin ch*Tel: 0983 484171, Email: xuanthuytbu@gmail.comcystatin IIkế vector chuyển gen mang cấu trúc cystatinII.,Sử dụng hai mẫu ngô địa phương thu thập ởtỉnh Sơn La (SL) và tỉnh Hà Giang (HG).RNA tổng số được tách chiết bằng TrizolReagent KIT; cDNA được tổng hợp theo quytrình Maxima® First Strand cDNA SynthesisKIT; gen cystatin được khuếch đại bằng kỹthuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu kỳnhiệt: 940C/4 phút - (940C/45 giây - 580C/30101Vì Thị Xuân Thủy và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆgiây - 720C/60 giây)30 chu kỳ - 720C/10 phút.Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện ditrên gel agarose 0,8%; tinh sạch sản phẩmPCR theo GeneJET PCR Purification KIT vàgắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạpvào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng sốcnhiệt (420C trong 1 phút 30 giây). Vi khuẩnmang vector tái tổ hợp được chọn lọc trênmôi trường LB đặc bổ sung X-g-PCRvới cặp mồi M13. Plasmid tái tổ hợp được thunhận bằng cách tách chiết theo phương pháptách dòng phân tử [7tự động ABI Prism 3130 - USA/Japan. Sốliệu được xử lý bằng phần mềm BioEdit,DNAStar.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNNhân bản gen cystatin II từ mRNACặp mồi đặc hiệu ZmCysF/Zmđể khuếch đại đoạn mã hoá của gen cystatin IItin về trình tự gen cystatin IIcystatin II ước tính khoảng 400 bp.ZmCysF:5‟ACCATGCCCAACAAACATCGAATCG 3‟ZmCysR:5‟TTAGGCGCTAGCACCCTCTTCA 3‟ngô 5 - 7 ngày tuổi, RNA tổng số được sửdụng làm khuôn cho phản ứng phiên mãngược tạo cDNA với mồi ngẫu nhiên(Random Hexamer Primer). Phản ứng PCRnhân bản đoạn mã hóa của gen cystatin II vớicặp mồi đã thiết kế ZmCysF/ZmCysR,1kb được thể119(05): 101 - 106cystatin II38130 trênNgân hàng gen Quốc tế. Như vậy, chúng tôicó thể sơ bộ kết luận đã nhân bản được gencystatin II từ RNA của hai mẫu ngô địaphương nghiên cứu.bào khả biến E.coli DH5α và chọn lọc khuẩnlạc trắng bằng phản ứng colony-PCR với cặpmồi M13. Những khuẩn lạc trắng dương tínhvới colony-PCR có khả năng mang vector táitổ hợp pBT_cystatin II. Sau khi tách plasmidtừ sinh khối vi khuẩn, chúng tôi thực hiệnkiểm tra sự có mặt của gen cystatin II bằngcách sử dụng enzyme giới hạn BamHI để cắtplasmid tái tổ hợp (Hình 1B).Theo tính toán lý thuyết, vector pBT có kíchthước 2700 bp, sản phẩm PCR gen đích 400bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thướckhoảng 3100 bp. Kết quả điện di kiểm tra(Hình 1B) cho thấy, các dòng khuẩn lạc trắngdương tính với colony-PCR đều mangplasmid tái tổ hợp (pBT_cystatin II). Cácplasmid tái tổ hợp được sử dụng để xác địnhtrình tự nucleotide.Xác định trình tự cDNA cystain II của haimẫu ngô nghiên cứuKết quả xác định trình tự nucleotide của gencystatin II2)cystatin IInucleotide của gen cystatin II công bố trên1).hiện ở hình 1A.400bp, hàm lượ102protein cystatinD38130 của GenBank (H3)protein cystatin134 aminoacid, trong đó có 9 amino acid sai khác ở cácvị trí cụ thể được trình bày ở bảng 2.Vì Thị Xuân Thủy và ĐtgMSLTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆHGM119(05): 101 - 106HGSLĐC~3100 bp~2700 bp500 bp~400 bp500 bp~400 bp250 bp250 bpABHình 1. A: ...