Đại cương Hóa sinh học: Phần 2

Giáo trình Thực hành hóa sinh học trang bị cho người học những kiến thức cơ bản. Đây là cuốn sách hữu ích dành cho các bạn sinh viên và những ai đang công tác trong ngành Hóa sinh dùng làm tài liệu tham khảo và nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đại cương Hóa sinh học: Phần 2 Chương 4 Axit nucleic Axit nucleic là thuật ngữ chung cho cả a x i t dezoxiribonucleic (ADN) và axit ribonucleic (ARN). Chúng là một trong những nhóm hợp chất chính, rất quan trọng của mọi tế bào và cơ thể sông. Cả ADN và ARN đểu được tạo thành từ các mononucleotit thông qua liên kết 3,5- photphođieste. Mỗi mononucleotit gồm bazơ nitơ hoặc là thuộc nhóm purin như adenin, gưanin hoặc là thuộc nhóm pirimidin như timin, xitozin, uraxin liên kết với gôc đường 5 các bon (5C) và axit photphoric. Sự khác nhau căn bản giữa ADN và ARN là ỏ gôc đường 5C; trong trường hợp ADN đường 5C là dezoxiribozơ, còn trong ARN là đường ribozơ. Ngoài ra, các gốc timin trong ADN được thay bằng gốic uraxin trong ARN. Đây là những cơ sở để nhận biết cũng như định lượng các loại axit nucleic này. 4.1 Các tính chât lí - hoá của axit nucleic 4.1.1 Tính tan của axit nucleic Axit nucleic hòa tan tốt trong môi trường kiểm, ít tan trong nước và không tan trong dung dịch axit axetic loãng. Trong 66 nưb) Phản úng phân biệt ADN và ARN Các phản ứng này chủ yêu dựa vào sự sai khác về thành phần đường giữa ARN chứa đưòng ribozơ và ADN chứa đường dezoxiribozơ. Hai loại đường này khác nhau về khả năng phản ứng với một số chất như ocxin, điphenilamin, thuổc thử Schiff... Sự sai khác chủ yếu là ở độ nhạy của phản ứng. Vì vậy tiêu chuẩn để xác định phản ứng là dương tính hay âm tính chủ yếu là dựa vào thời gian xảy ra phản ứng. Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch ARN nấm men 0 ,1 %, dung dịch ADN gan động vật 0 ,1 %, HC1 IN, NaOH 0 ,1 N. - Thuốc thử ocxin (xem mục 3.1.l.h) - Chuẩn bị thuốc thử điphenylamin: hòa tan lg điphenylamin trong 100ml axit axetic đặc, thêm 2,75ml H2S0 4 đặc. - Chuẩn bị thuốc thử Schiff: hòa tan 0 ,2 g fucsin trong 1 2 0 ml nưốc cât nóng. Làm lạnh, thêm từ từ dung dịch NaHS03 đến khi dung dịch có màu. Thiết bị: Nồi cách thủy ( 10 0 °C). Cách làm: - Phản ứng với thuốc thử ocxin: Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào ông I: lml dung dịch ARN 0 , 1 %, ông II: lml dung dịch ADN 0 , 1 %. Thêm vào mỗi ống lml thuốc thử ocxin, lắc, giữ 15 phút trong nồi cách thủy đang sôi. Ông I có màu xanh lục, ổng thứ II cho màu rất nhạt. - Phản ứng với điphenylamin. 68 Chuẩn bị hai ông nghiệm, cho vào ông I: lml dung dịch ARN 0 , 1 %, ỏng 11:1ml dung dịch ADN 0 , 1 %, thêm vào mỗi ống 2 ml thuôc thử điphenylamin, lắc đều, giữ cả hai ông nghiệm 10 phút trong nồi cách thủy đang sôi. Ông có chứa ADN chuyển sang mau xanh, ông chứa ARN cho phản ứng âm. *Phản ứng Feulgen VỚI dezoxiribozơ. Cho vào ống nghiệm lml dung dịch ADN 0,1%, thêm 5-6 giọt HC1 giữ 5 phút trong nồi cách thủy đang sôi, làm lạnh, dùng dung dịch NaOH 0 ,lN đê điều chỉnh pH đến 5. Thêm 2 ml thuốc thử Schiff, xuất hiện màu đỏ chứng tỏ có dezoxiribozơ. ARN không cho phản ứng này. c) Thủy phân và nhận biết các thành phẩn cấu tạo của axit nucleic Dưới tác dụng của axit vô cơ ở nhiệt độ cao, ARN bị thủy phân tạo thành các bazơ purin tự do và các nucleotit pirimidin. Có thể nhận biết các thành phần đưòng pentozơ, axit photphoric và bazơ nitơ bằng các phản ứng đặc trưng. Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch ARN 0,1%, H2S0 4 1 0 % hoặc HC1 IN, HN03 đặc, HC1 đặc, dung dịch amoni molipđat 5%, AgNO;ỉ trong NH4OH, NaOH 1 N, dung dịch đồng sunfat 1 %, NaHS03 bão hòa, florogluxm tinh thể. Thiết bị: Nồi cách thủy (10 0 °C). Cách làm : Thủy phân ARN: cho 10 ml dung dịch ARN 0 , 1 % vào bình nón dung tích 50ml, thêm 1 0 ml H2S0 4 1 0 %đật vào nồi cách t hủy đang sôi trong 45 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Dung dịch thủy phân nhận được dùng để làm các phản ứng tiếp theo. * Phản ứng nhận biết pentozơ: cho vào ống nghiệm lml dung dịch thủy phân của ARN, thêm lml HC1 đặc và một vài 69 tinh thể florogluxin. Đun sôi dung dịch, xuất hiện màu đỏ chứng tỏ có pentozơ. - Phản ứng nhận biết H3P 0 4: lấy 0,5ml dung dịch thủy phân của ARN, trung hòa bằng amoniac. Thêm 0,5ml HN03 đặc và 2 ml dung dịch amoni molipđat. Đun sôi, tạo thành kết tủa vàng của amoni photphomolipđat. - Phản ứng nhận biết các bazơ purin: Cho vào ống nghiệm lml dung dịch thủy phân của ARN, thêm dung dịch amoniac đến khi có phản ứng kiềm yếu. Lọc đê nhận được dung dịch trong, thêm 3ml dung dịch bạc nitrat trong amoniac. Xuất hiện kết tủa purin không tan trong dung dịch amoniac của muối bạc. Cho vào ống nghiệm lml dung dịch thủy phân của ARN, thêm NaOH IN cho đến phản ứng axit yếu trên giấy Congo. Đun sôi, thêm 4-6 giọt dung dịch C11SO4 1 %và thêm cẩn thận từng giọt dung dịch NaHS03 bão hòa. NaHS03 khử ion Cu2+ thành Cu*. Ion Cu* tạo thành muổi đồng vói bazơ purin không hòa tan. 4.2 Định lượng axỉt nucleic 4.2.1 Định lượng ADN a) Định lượng ADN bảng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở buúc sóng 260 nm Nguyên tắc: Trong thành phần ADN chứa các bazơ ...