Giải mã trình tự ADN

Trong phần này chúng ta sẽ xem xét bằng cách nào có thể xác định được trình tự nucleotit của các phân đoạn hoặc toàn bộ phân tử ADN mong muốn. Về một khía cạnh nào đó, có thể coi giải mã trình tự các nucleotit là việc đánh dấu mẫu dò triệt để nhất của một hệ gen với tính chọn lọc cao.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giải mã trình tự ADN Giải mã trình tự ADNTrong phần này chúng ta sẽ xem xétbằng cách nào có thể xác định được trìnhtự nucleotit của các phân đoạn hoặc toànbộ phân tử ADN mong muốn. Về mộtkhía cạnh nào đó, có thể coi giải mãtrình tự các nucleotit là việc đánh dấumẫu dò triệt để nhất của một hệ genvới tính chọn lọc cao.Chúng ta sẽ xác định toàn bộ trình tự hệgen của các cơ thể sinh vật có mức độcấu tạo phức tạp khác nhau từ vi khuẩncho đến loài người, và điều này chophép chúng ta tìm thấy mọi trình tự đặchiệu một cách nhanh và chính xác thôngqua việc sử dụng các phần mềm máytính với các thuật toán phù hợp.Hay nói cách khác, ”các chất chọn lọc”của chúng ta ở đây là các chuỗi bazơnitơ được chúng ta nhập vào phần mềmmáy tính. Do cơ sở dữ liệu về các hệgen ngày càng trở nên phong phú, nênngày càng trở nên dễ dàng hơn để có thểtìm thấy các bản sao của trình tự các hệgen hoặc của các trình tự có liên quantrong cùng một loài hoặc của các loàikhác. Rõ ràng, việc giải mã trình tự cácnucleotit đã tạo ra một cơ sở dữ liệukhổng lồ phục vụ cho các nghiên cứugiải mã trình tự và so sánh giữa các hệgen .Nguyên tắc giải mã trình tự ADN về cơbản dựa trên việc phân tách các phânđoạn ADN có kích thước khác nhauđược giới hạn bởi hai đầu. Các phân tửADN đều giống nhau ở phần đầu 5’,nhưng kết thúc ở phía đầu 3’ có cácnucleotit khác nhau. Các thành viên củamột nhóm sẽ có nucleotit ở phía đầu 3’giống nhau. Như vậy, trong một nhómsẽ bao gồm tất cả các phân tử ADN tậncùng đầu 3’ bằng G, nhóm khác tươngứng là A, C và T. Trong mỗi nhóm cácphân tử sẽ có kích thước khác nhau phụthuộc vào vị trí của nucleotit tương ứng(ví dụ như G) nằm trên phân tử ADN.Các phân đoạn khác biệt về chiều dàinhư vậy có thể phân tách được nhờ sửdụng kỹ thuật điện di trên gelpolyacrylamid. Chẳng hạn khi chạy hỗnhợp các phân tử ADN tận cùng đầu G tasẽ thu được thang các băng điện ditương ứng với các phân đoạn, trong đómỗi băng tương ứng với một phân đoạncó chiều dài phản ánh vị trí của nucleotitG trên phân tử ADN.Giải mã trình tự hệ gen vi khuẩn bằngkỹ thuật shotgun (”giải mã từng đoạnngẫu nhiên”)Vi khuẩn gây bệnh kiết lị ở ngườiHemophilus influenza là loài sinh vật đầutiên được giải mã toàn bộ hệ gen. Sở dĩhệ gen của loài này được hoàn thànhviệc giải mã đầu tiên là nhờ hệ gen củanó nhỏ, chỉ chứa một phân tử ADN duynhất kích thước 1, 8 Mb. Hệ gen của vikhuẩn này được ”cắt” thành các phânđoạn nhỏ có kích thước trung bìnhkhoảng 1 kb. Các đoạn ADN hệ gen nàysau đó được tách dòng bằng các véctơADN plasmit tái tổ hợp. ADN từ cácdòng vi khuẩn chứa các phân đoạn ADNtái tổ hợp riêng rẽ rồi được giải mã trìnhtự riêng rẽ trên các máy giải mã trình tựtự động sử dụng phương pháp ddNTP.Phương pháp này được gọi là phươngpháp giải mã trình tự kiểu ”shotgun”(bắn ngẫu nhiên). Các khuẩn lạc mangcác véctơ tơ tái tổ hợp mang đoạn ADNcài ngẫu nhiên được phân lập, xử lý vàgiải mã trình tự. Để chắc chắn rằng mọinucleotit trong hệ gen vi khuẩn đều cómặt trong các dòng vi khuẩn của thưviện hệ gen, tổng cộng có khoảng30.000 - 40.000 dòng tái tổ hợp khácnhau được sử dụng và giải mã trình tự.Từ đó, tạo ra khoảng 20 Mb dữ liệu thôvề hệ gen (các phản ứng tạo ra trình tựcó kích thước trung bình 600 bp, và 20Mb = 600 bp x 33.000 dòng vi khuẩn).Dữ liệu này được gọi là vùng trình tự10x. Bởi vì, mỗi nucleotit trong hệ genđược đọc lặp lại khoảng 10 lần.Phương pháp này dường như là tốnnhiều công sức, nhưng chi phí rẻ hơn vànhanh hơn so với các phương pháptruyền thống khác. Một phương phápgiải mã trình tự trước đây dựa trênnguyên tắc giải mã từng phân đoạnADN cắt giới hạn trên bản đồ vật lýcủa nhiễm sắc thể vi khuẩn. Một hạnchế của kỹ thuật này là hầu hết cácphân đoạn cắt giới hạn có kích thướclớn hơn kích thước có thể giải mã trìnhtự hoàn toàn trong mỗi phản ứng đượcthực hiện. Do vậy, để giải mã toàn bộhệ gen, người ta phải tiến hành cắt giớihạn, lập bản đồ và giải mã trình tựnhiều lần. Các bước này nếu lặp đi lặplại nhiều lần sẽ tồn nhiều thời gian hơnkhi sử dụng phương pháp giải mã trìnhtự tự động của các phân đoạn ADNngẫu nhiên. Hay nói cách khác, nhờ sửdụng phần mềm máy tính việc sắp xếplại các phân đoạn ADN ngẫu nhiên vẫnnhanh hơn nhiều việc lập bản đồ cácphân đoạn cắt giới hạn trên NST vikhuẩn.Khoảng 30.000 đoạn trình tự ADN đượcgiải mã trình tự ngẫu nhiên được trựctiếp nhập vào phần mềm máy tính.Nhiều phần mềm máy tính chuyên dụnghiện nay có thể xếp các đoạn trình tựtheo đúng thứ tự dựa trên các trình tự gốilên nhau của chúng. Sự ”lắp ráp” thànhtrình tự của các phân đoạn ADN ngắncuối cùng sẽ có một trình tự liên tục duynhất, còn được gọi là một contig.Kỹ thuật giải mã trình tự kiểu shotguncho phép ”ráp nối” từng phần của hệgen lớnNhư đã trình bày ở trên việc giải mã cácđoạn trình tự ADN kích thước khoảng6 ...