Giáo án điện tử sinh học: Sinh học lớp 12-2.5.NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VÀ ỨNG DỤNG

Tế bào trần thực vật (protoplast) là tế bào đã được loại bỏ thành tế bào chỉ còn màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào. b. Tế bào trần được sử dụng trong nghiên cứu: + lai cùng loài hay khác loài + chuyển gen + có khả năng tạo màng tế bào nhanh chóng đây là cơ sở ngghiên cứu quá trình tổng hợp màng tế bào
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo án điện tử sinh học: Sinh học lớp 12-2.5.NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VÀ ỨNG DỤNG2.5.NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VÀ ỨNG DỤNG2.5.1. khái niệm và kỹ thuậttách tế bào trần thực vật a. KN: Tế bào trần thực vật(protoplast) là tế bào đã được loại bỏthành tế bào chỉ còn màng sinh chấtbao bọc khối tế bào chất và nhân tếbào. b. Tế bào trần được sử dụng trongnghiên cứu: + lai cùng loài hay khác loài + chuyển gen + có khả năng tạo màng tế bàonhanh chóng đây là cơ sở ngghiên cứuquá trình tổng hợp màng tế bàoc. Tách tế bào trần ( 2 cách : cơ học và enzym): sau đây là các bước cơ bản:- Mẫu lá non được rửa sạch với vòi nướcmáy.sát trùng bằng cồn 70-75 độ sau đó rửabằng nước cất 3 lần, sau đó khử trùng bằngNa-hypochlorit hay Ca-hypochlorit khảng 7-15phút. Lá làm sạch lá bằng Clorox 10% trong Lá10 phút, rửa lại lá 3 lần bằng nước cất tiệttrùng- Ngâm lá vào dung dịch mannitol 8-15%trong 45-60 phút để tế bào co nguyên sinh.- Tách lớp biểu bì mặt dưới lá để enzymngấm sâu vào nhu mô thịt lá.- Cắt lá thành từng mảnh nhỏ, ngâm 1g látrong đĩa petri. Dung dịch enzym gồmcellulase, hemicellulase,pectinase +manitol13%. Đặt mẫu trong tối qua đêm (12-18 giờ,ở 25 độ) thu được hỗn hợp protoplast.- Dịch protoplast ly tâm trong 5 phút, bỏphần bã nổi lên trên,protoplast ở đáy. Rửabằng 10ml dung dịch môi trường MS +Manitol 13%,thao tác thực hiện 3 lần.d. Xác định mật độ protoplast và khả năng sống sót Nhuộm protoplast bằng Fluorescein diacetate để xácđịnh sự sống sót của protoplast. Số lượng protoplastđược xác định bằng buồng đếm hồng cầu.e. Nuôi cấy protoplast2.5.2. Dung hợp tế bào trần và lai vôtínha. Tự dung hợp vì màng sinhchất của tếbào(-) do nhómP và Protein nêncác tế bào trầnđẩy nhau nênkhông tự dunghợp. Do đó phảilàm các rế bàotrần tiếp xúcnhau nhờ PEGhay sốc điện. b. Hóa dung hợp: Sự hóa dung hợp có thể thực hiện với NaNO3 0,25M, PVA15 %…nhưng tần số dung hợp thấp nên ít được sử dụng. Virut Senday đã giảm hoạt tính là chất th ường dùng hi ệnnay bằng cách cho giọt hỗn hợp 2 loại tế bào trần tiếp xúc t ừtừ với các giọt PEG 25- 50% c.Điện dung hợp (tốtnhất): Khi đặt hỗn hợp 2 loại tế bào trần trong 1 điện trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc nhau và xếp thành 1 chuỗi dài dưới lực điện trường Sau đó dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt ở màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc. Khi dung hợp tế bào trần với nhau thường có ba nguồn gen tham gia (nhân,tythể,lạp thể). Có thể xảy ra các hiện tượng: - chỉ dung hợp nguyên sinh chất và các cơ quan tử - chỉ có sự dung hợp nhân - có cả dung hợp nhân và tế bào chất TH 1 -> các tế bào cybride. TH 2 và 3 ->tế bào lai th ực th ụ hybride. Ứng dụng: bằng phương pháp lai tế bào đã thành công trong tạo cây lai từ hai loài thuốc lá khác nhau, cây lai giữa khoai tây và cà chua.2.5.3. Biến nạp gen vào protoplast thực vậta. Phương pháp đưa AND vào cơ thể và tế bào khác - Phân lập AND bằng các phương pháp khác nhau: PCR,sử dụng enzym phiên mã ngược, tách gen bằng RE. - Sử dụng các vector tự nhiên để biến nạp vào tế bào. + thể thực khuẩn bám vào thành tế bào đưa AND vào tế bào ch ủ, trong tế bào chủ AND của genom của phage biểu hiện và tổng hợp phage mới. + Plasmid: ngày nay người ta đã thiết kế được nhiều loại plasmid để đưa AND lạ vào tế bào. a. Biến nạp gen vào protoplast thực vật Các bước biến nạp:•Phân lập mARN của gen A: chọn loại tế bào và giai đoạn thích h ợp mà ở đó quá trìnhsao mã sảy ra mạnh. Phân lập bawnngf các kỹ thuật: điện di,sắc ký.• tổng hợp gen invitro: bằng enzym phiên mã ngược thu được cADN• Sử dụng cADN đặc trưng làm phân tử đánh dấu để phân lập đoạn gen tương đồngtrong thư viện genom• Gắn với vector: thường sử dụng các plasmid kháng kháng sinh để tiện lợi cho ch ọnsản phẩm biến nạp sau này. Dùng RE để mở vòng plasmid, enzym ligase để nối ANDtạo thành AND tái tổ hợp.• Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào: có các phương pháp sau: + biến nạp bằng hóa chất: chủ yếu dùng PEG (polyethylen glycol) + biến nạp bằng xung điện + biến nạp bằng súng bắn gen + biến nạp thông qua agrobacterium• họn lọc sản phẩm biến nạp : nuôi trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh đặc hiệu,chỉ những tế bào có plasmid mang gen kháng sinh có thể sống sót và phát tri ển,từ đóchọn được tế bào biến nạp thành công.• Đánh giá kết quả biến nạp và theo dõi số phận của các gen biến nạp theo các cáchsau: + theo dõi biểu hiện của gen biến nạp + Phân lập và nhân gen biến nạp bằng kỹ thuiaatj PCR + Phân tích RFLP ...