Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 2

Chương 2: CÔNG CỤ CHUYỂN GEN: PLASMID VÀ BACTERIOPHAGEMột phân tử DNA cần phải bộc lộ 1 vài đặc trưng tiêu biểu để có thể dùng như 1 công cụ để tạo dòng gen (gene cloning). Quan trọng nhất là chúng phải có khả năng tái bản trong tế bào chủ (host cell), tạo được 1 số lượng lớn các bản sao (copies ) của phân tử DNA tái tổ hợp (recombinant DNA molecule) và truyền được qua các tế bào con (daughter cells) . Một công cụ tạo dòng còn đòi hỏi phải có kích thước khá nhỏ, lý...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 2Chương 2: CÔNG CỤ CHUYỂN GEN: PLASMID VÀ BACTERIOPHAGEMột phân tử DNA cần phải bộc lộ 1 vài đặc trưng tiêu biểu để có thể dùng như 1công cụ để tạo dòng gen (gene cloning). Quan trọng nhất là chúng phải có khảnăng tái bản trong tế bào chủ (host cell), tạo được 1 số lượng lớn các bản sao(copies ) của phân tử DNA tái tổ hợp (recombinant DNA molecule) và truyềnđược qua các tế bào con (daughter cells) . Một công cụ tạo dòng còn đòi hỏi phảicó kích thước khá nhỏ, lý tưởng nhất là nhỏ hơn 10 kb. Bởi vì những phân tử lớnsẽ dễ bị gãy vỡ trong quá trình tinh sạch và khó khăn hơn khi thao tác. Hai lọaiphân tử DNA thỏa mãn được các tiêu chuẩn trên đã được tìm thấy trong tế bào vikhuẩn, đó là plasmid và nhiễm sắc thể của bacteriophage. Mặc dù plasmids thườngđược dùng để làm công cụ tạo dòng (cloning vehicles), nhưng 2 trong số nhữnglọai vector quan trọng nhất được sử dụng ngày nay lại bắt nguồn từ thực khuẩn thể(bacteriophage).2.1 PLASMIDS:2.1.1 Đặc trưng cơ bản của plasmids:Plasmids là những phân tử DNA dạng vòng , tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn( hình 2.1) .Plasmids hầu hết luôn mang 1 hoặc nhiều gen, và thường thì các gennày đảm nhiệm các đặc tính hữu ích được bộc lộ trong tế bào vi khuẩn chủ. Ví dụ,như khả năng sống sót được ở môi trường có kháng sinh (chloramphenicol hayampicillin) thường phụ thuộc vào sự hiện diện của plasmid có mang gen khángkháng sinh chứa trong vi khuẩn đó. Trong phòng thí nghiệm thì những gen khángkháng sinh này thường được dùng như 1 phân tử đánh dấu (selectable marker )để đảm bảo vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy có chứa 1 plasmid cụ thể nàođó.(hình 2.2)Hình 2.2:sử dụng gen kháng kháng sinh để làm marker chọn lọc cho plasmids RF4- RF4 có chứa gen kháng ampicilin, kanamycin, tetrcycline- Cho hỗn hợp có E.Coli chứa RF4 và ko chứa RF4 vào môi trường ko có khángsinh thì tất cả đều sống- Cho hỗn hợp có E.Coli chứa RF4 và ko chứa RF4 vào môi trường có 50µm/mltetracyline thì tất cả chỉ những plasmid có chứa RF4 mới sống được.Tất cả các plasmid đều sở hữu ít nhất là 1 chuỗi DNA, có thể hoạt động như làđiểm bắt đầu của sự sao mã. Chúng có thể nhân lên 1 cách hoàn toàn độc lập vớinhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn. (hình 2.3(a)) Những plasmids nhỏ hơn thì lợidụng các enzymes sao mã DNA của chính tế bào chủ để tạo nên các bản copiescủa chúng .Trong khi đó, 1 số plasmid lớn hơn thì có mang nhiểu gen mã hóa chocác enzymes đặc biệt cần thiết cho sự tái bản của chúng.Một vài loại plasmid còn có thể sao mã bằng cách chen vào nhiễm sắc thể vikhuẩn (hình 2.3 (b)). Những plasmid hợp nhất thêm hay các thể bổ sung(episomes) có thể duy trì 1 cách ổn định dưới dạng này trong suốt quá trình phânchia của tế bào, nhưng đến giai đoạn nào đó chúng sẽ tách ra và tồn tại như 1 yếutố độc lập. Sự hợp nhất này cũng là 1 đặc trưng quan trọng của 1 vài nhiễm sắc thểcủa bacteriophage, nó sẽ được mô tả chi tiết hơn khi chúng ta quan tâm (p.20).2.1.2 Kích thước và số lượng copy (copy number)Hai đặc trưng này là đặc biệt quan trọng, có liên quan đến sự tạo dòng gen(cloning). Kích thước plasmid thích hợp và lý tưởng nhất để làm công cụ tạodòng là nhỏ hơn 10 kb. Kích thước plasmid thường trong khoảng từ 1.0 kb (nhỏnhất) đến 250 kb (lớn nhất) (bảng 2.1), nhưng chỉ có 1 số ít là hữu ích cho mụcđích tạo dòng. Tuy nhiên những plasmid lớn hơn cũng có thể thích hợp cho việctạo dòng trong 1 số trường h ợp cụ thể (sẽ được mô tả ở Chương 7).Số lượng copy t ức là số lượng các phân tử của 1 plasmid riêng biệt mà bìnhthường được tìm thấy trong 1 tế bào vi khuẩn đơn lẻ. Các nhân tố kiểm soát sốlượng copy này thì chưa được hiểu rõ, nhưng mỗi plasmid đều có 1 trị số bản copyđặc trưng, có thể là thấp (đặc biệt đối với các phân tử lớn) và cũng có thể là cao(khoảng 50 hoặc hơn nữa). Nói chung, 1 công cụ tạo dòng hữu ích thì cần phảihiện diện trong tế bào với số lượng thật nhiều để có thể thu được số lượng lớn cácphân tử DNA tái tổ hợp.2.1.3 Sự tiếp hợp (Conjugation) và sự tương hợp (compatibility)Plasmids được chia làm 2 nhóm : tiếp hợp (conjugation) và không tiếp hợp (non-conjugation). Plasmid tiếp hợp thì được mô tả bởi khả năng thúc đẩy quá trìnhtiếp hợp giới tính giữa các tế bào vi khuẩn (hình 2.4), kết quả là plasmid tiếp hợpcũng sẽ truyền từ 1 tế bào sang tất cả các tế bào còn lại trong môi trường nuôi cấy.Sự tiếp hợp và việc chuyển các plasmid được kiểm soát bởi 1 gen tải nạp (còn gọilà gen “tra” ). Tra gene hiện diện trong plasmid tiếp hợp và vắng mặt trongplasmid không tiếp hợp. Tuy nhiên trong 1 số trường hợp, plasmid không tiếp hợpcó thể kết hợp di chuyển cùng với 1 plasmid tiếp hợp khi cả 2 đều hiện diện trongcùng 1 tế bào.Vài loại plasmid khác cũng có thể được tìm thấy trong 1 tế bào đơn, gồm nhiềuhơn 1 plasmid tiếp hợp ở bất cứ thời gian nào. Sự thật là tế bào E. coli được biếtthì có chứa đến 7 plasmids khác nhau cùng lúc. Để kết hợp tồn tại được trong cùng1 tế bào ...