Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 3

Chương 3CHƯƠNG 3: TINH SẠCH DNA TỪ TẾ BÀO SỐNGKỹ thuật di truyền tại nhiều thời điểm khác nhau, cần chuẩn bị ít nhất 3 loại DNA riêng biệt. Trước hết, total cell DNA sẽ được yêu cầu như một nguồn nguyên liệu từ các gen để tiến hành clone. Total cell DNA có thể là DNA từ nuôi cấy vi khuẩn, từ cây trồng, từ các tế bào động vật hoặc từ các nguồn sinh vật đang được nghiên cứu khác. Loại DNA thứ 2 được yêu cầu là DNA plasmid tinh khiết. Việc chuẩn bị DNA plasmid từ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 3Chương 3CHƯƠNG 3: TINH SẠCH DNA TỪ TẾ BÀO SỐNG Kỹ thuật di truyền tại nhiều thời điểm khác nhau, cần chuẩn bị ít nhất 3 loạiDNA riêng biệt. Trước hết, total cell DNA sẽ được yêu cầu như một nguồn nguyênliệu từ các gen để tiến hành clone. Total cell DNA có thể là DNA từ nuôi cấy vikhuẩn, từ cây trồng, từ các tế bào động vật hoặc từ các nguồn sinh vật đang đượcnghiên cứu khác. Loại DNA thứ 2 được yêu cầu là DNA plasmid tinh khiết. Việc chuẩn bịDNA plasmid từ nuôi cấy vi khuẩn theo những b ước tương tự cơ bản như việc tinhkhiết total cell DNA, nhưng điểm quan trọng là tại vài giai đoạn, DNA plasmid phảiđược phân chia từ một số lượng lớn DNA nhiếm sắc thể cùng tồn tại trong tế bào. Cuối cùng, DNA phage được sử dụng trong kỹ thuật cloning phage. DNAphage nhìn chung được chuẩn bị từ các hạt bacterriophage hơn từ việc ly trích từ tếbào nhiễm. Vì vậy, không gây nhiễm đối với DNA của vi khuẩn. Tuy nhiên, cần cónhững kỹ thuật đặc biệt để phá vỡ lớp vỏ phage. Một ngoại lệ là dạng sao mã mạchđôi của M13 từ các tế bào E.coli dường như giống với plasmid vi khuẩn. 3.1. Việc chuẩn bị total cell DNA. Nguyên tắc cơ bản của việc chuẩn bị DNA là ( ) Quy trình của sự chuẩn bị DNA total từ việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn có thểđược phân chia thành 4 giai đoạn (hình 3.1): 1. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn tăng sinh khối và thu hoạch 2. Phá vỡ tế bào để giải phóng các thành phần tế bào 3. Phần trích của tế bào được xử lý để rút các thành phần, thu nhận DNA 4. Cô đặc dung dịch DNA thu được 3.1.1. Tăng sinh khối và thu hoạch trong nuôi cấy vi khuẩn: Hầu hết các vi sinh vật có thể tăng trưởng trong môi trường lỏng (môi trườngcanh) không quá khó khăn. Môi trường nuôi cấy phải cung cấp một hỗn hợp cânbằng chất dinh dưỡng thiết yếu trong dung dịch quy định cho phép vi khuẩn sinhtrưởng và phân chia hiệu quả. Hai môi trường tăng trưởng điển hình được mô tả chitiết ở bảng 3.1. M9 là một ví dụ của defined medium trong đó tất cả các thành phầnđều được biết. Môi trường chứa hỗn hợp các chất dinh dưỡng vô cơ để cung cấp cácyếu tố thiết yếu như nitrogen, Mg, Ca, hơn nữa là cung cấp glucose bổ sung cacbonvà năng lượng. Thực tế, có các yếu tố tăng trưởng cộng thêm như trace elements vàvitamin, phải được thêm vào môi trường M9 trước để hỗ trợ cho sự tăng trưởng củavi khuẩn. Chính xác, thành phần bổ sung phụ thuộc vào mỗi loại vi khuẩn. Môi trường thứ hai được mô tả ở bảng 3.1 có sự khác biệt hơn. LB là hỗnhợp phức tạp hay undefined medium, tính chất và số lượng của các thành phầnkhông được xác định. Đó là do hai thành phần, tryptone và phần trích từ nấm men,là một phức hợp hóa học phức tạp. Tryptone cung cấp amino acid và các peptidenhỏ. Dịch trích từ nấm men (tế bào nấm men trong đường tiêu hóa) cung cấpnitrogen cùng với đường, các chất dinh dưỡng vô cơ và hữu cơ. Môi trường phứctạp như LB ( ). 1Chương 3 Define medium phải được sử dụng khi việc nuôi cấy vi khuẩn được tiến hànhdưới điều kiện kiểm soát tuyệt đối. Trong môi trường LB tại 370C, được cung cấpoxi bằng việc lắc với tốc độ 150-250 r.p.m trên trục quay, tế bào E.coli phân chia 20phút một lần hoặc hơn cho đến khi dịch nuôi cấy đạt được một độ cực đại khoảng 2-3 tb/ml. Sự tăng trưởng của dịch nuôi cấy có thể được kiểm tra thông qua việc đọcmật độ ánh sáng (OD) ở 600nm (hình 3.2), bước sóng của 1 đơn vị OD tương ứngvới khoảng 0,8.109 tb/ml. Để chuẩn bị dịch chiết tế bào vi khuẩn phải được chứa trong một dung tíchnhỏ tới mức có thể. Việc thu hoach vì vậy được thực hiện thông qua việc ly tâmdịch nuôi cấy (hình 3.3). Tốc độ giảm của máy ly tâm sẽ lắng tụ vi khuẩn xuống đáyống ly tâm, cho phép trích dịch nuôi cấy. Vi khuẩn từ dich nuôi 1000ml ở mật độ tếbào cực đại chỉ cần thu lại trong một dung tích 10ml hoặc ít hơn bả vi khuẩn. Hình 3.2: Đánh giá số lượng tế bào vi khuẩn thông qua đo lường mật độquang (a). Dịch nuôi cấy chứa trong bình thủy tinh và ánh sáng bước sóng 600nmchiếu qua. Lượng ánh sáng chiếu qua dịch nuôi cấy được đo và tính toán mật độquang như sau: cường độ ánh sáng truyền đi 1 đơn vị OD = -log10 cường độ ánh sáng truyền tới Hệ thống này được thực hiện nhờ quang phổ kế. Lượng tế bào tương ứng vớiviệc đọc OD được tính toán từ đường cong xác định giá trị. Đường cong này đượcvẽ từ giá trị OD dịch đó mật độ tb đã biết.Ví dụ: E.coli 1 đơn vị OD = 0,8.109 tb/ml a) Đo mật độ quang: b) Đánh giá số lượng tế bào từ đường cong xác định giá trị. 3.1.2. Chuẩn bị dịch trích tế bào: Tế bào vi khuẩn được bọc bên trong lớp màng cytoplasmic và bao xungquanh bởi thành tế bào cứng. Ở nhiều loài, như E.coli, thành tế bào là lớp màng bênngoài thứ hai. Để giải phóng ...