Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 4

Chương 4CHƯƠNG 4: THAO TÁC VỚI DNA TINH KHIẾTTrước hết, chuẩn bị mẫu DNA tinh khiết.Bước tiếp theo trong một thí nghiệm tách dòng gen là xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp.Để tạo ra phân tử tái tổ hợp này, vector cũng như DNA được tạo dòng, phải được cắt tại những điểm riêng biệt và sau đó nối lại với nhau một cách có kiểm soát.Cắt và nối là hai vídụ về kĩ thuật thao tác DNA, gồm nhiều kỹ thuật đã được phát triển trên nhiều năm qua.Khi được cắt và nối, phân tử DNA có...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 4Chương 4 CHƯƠNG 4: THAO TÁC VỚI DNA TINH KHIẾT Trước hết, chuẩn bị mẫu DNA tinh khiết.Bước tiếp theo trong một thí nghiệm táchdòng gen là xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp.Để tạo ra phân tử tái tổ hợp n ày, vectorcũng như DNA được tạo dòng, phải được cắt tại những điểm riêng biệt và sau đó nốilại với nhau một cách có kiểm soát.Cắt và nối là hai vídụ về kĩ thuật thao tác DNA,gồm nhiều kỹ thuật đã được phát triển trên nhiều năm qua.Khi được cắt và nối, phântử DNA có thể ngắn lại, dài ra, sao chép thành RNA hoặc thành phân tử DNA mới vàđược sửa chữa bằng việc thêm vào hoặc lấy đi những nhóm hóa học đặc biệt.Tất cảnhững thao tác này có thể được thực hiên trong một ống nghiệm, ngoài việc cung cấpnền tảng cho tách dòng gen,nó còn sử dụng cho những nghiên cứu cơ bản trongsinh hóa học DNA, cấu trúc gen và kiểm soát biểu hiện gen. Hầu hết các kỹ thuật thao tác DNA đều sử dụng enzyme tinh khiết. Các enzymenày tham gia vào các quá trình thiết yếu bên trong tế bào như sao chép DNA và dịchmã, phá vỡ các phân tử DNA không mong muốn hoặc DNA ngoại lai (ví dụ DNAvirú xâm nhập vào) sửa chữa các DNA bị biến đổi và tái tổ hợp (recombination) giữacác DNA khác nhau.Sau khi được tinh sạch từ tế bào, các enzyme này có khả năngthực hiện những phản ứng tự nhiên (sẵn có) của chúng hoặc những phản ứng có quanhệ gần gũi với chúng, trong điều kiện nhân tạo.Mặc dù những phản ứng enzyme nàykhá dễ hiểu, nhưng khi thực hiện chúng không thể xảy ra hoàn toàn như các phươngpháp hóa học chuẩn.Vì vậy, những enzyme này giữ vai trò quyết định trong kỹ thuậtdi truyền và một ngành công nghiệp quan trọng xuất hiện làm công việc chuẩn bịenzyme, mô tả đặc tính enzyme và tiếp thị chúng.Các công ty điều chế enzyme tinhkhiết cao đã cung cấp cho các nhà sinh học phân tử các nhu cầu cần thiết Thao tác cắt và nối trong tách dòng gen được thực hiện bởi những enzyme được gọi là restriction enzyme (dùng để cắt) và ligase ( để nối).Trong chương này hầu hết sẽ liên quan đến những cách thức sử dụng hai loại enzyme này.Tuy nhiên, trướchết phải xem toàn bộ vùng DNA enzyme thao tác để xác định chính xác kiểu phảnứng gì có thể được thực hiện.Những chương sau sẽ mô tả cách thức sử dụng những loại enzyme này.4.1 VÙNG ENZYME THAO TÁCNhững enzyme này có thể được nhóm thành 5 loại lớn phụ thuộc vào loại phản ứng mà chúng xúc tác1. Nucleases: là những enzyme cắt, làm ngắn lại hoặc suy thoái phân tử DNA.2. Ligases: nối các phân tử acid nucleic lại với nhau.3. Polymerases: sao chép các phân tử.4. Nhóm enzyme sửa chữa(Modifying enzymes): cắt bỏ hoặc thêm vào các nhóm hóa học.5. Topoisomerases: phá vỡ hoặc tạo ra hiện tượng xoắn đoạn DNA vòngTrước khi xem xét chi tiết từng loại enzyme, cần làm 2 điểm sau. Đầu tiên chia 1Chương 4mỗi enzyme thành 1 loại cụ thể, trong một số trường hợp enzyme cũng có thể thuộc hai hay nhiều hơn một loại.Quan trọng nhất, nhiều polymerase có khả năng xúc tác để tạo thành những phân tử DNA mới hoặc sửa chữa enzyme.Thứ hai, nên hiểu rõrằng, cũng như những enzyme thao tác trên DNA, người ta cũng đã biết nhữngenzyme tương tự có khả năng hoạt động trên RNA. Sử dụng ribonuclease để loại bỏ những RNA tạp nhiễm khi chuẩn bị DNA mẫu là một ví dụ của enzyme.Mặc dùmột số enzyme thao tác trên RNA được ứng dụng trong tách dòng gen và sẽ được đề cập ở những chương kế tiếp, chúng ta sẽ giới hạn những hiểu biết vào những enzyme hoạt động trên DNA.4.1.1NucleasesNuclease phân hủy phân tử DNA bằng cách bẻ gãy cầu nối phosphodiester liên kếtgiữa hai nucleotide trong cùng một mạch.Có hai loại nucleotide riêng biệt(hình 4.1)Hình 4.1 Phản ứng xúc tác của hai loại nuclease khác nhau(a).Exonuclease phân hủy nucleotide từ ngoài vào.(b)Endonuclease bẻ gãy cầu nối phosphodiester từ bên trong. 1. Exonucleases, phân hủy lần lượt từng nucleotide từ điểm bắt đầu của phân tử DNA. 2. Endonucleases, phá vỡ cầu nối phosphodiester bên trong phân tử DNA.Điểm khác biệt chủ yếu giữa các loại exonuclease là số mạch được phân hủy khienzyme này tấn công vào phân tử mạch đôi. Enzyme Bal31 (tinh chế từ vi khuẩnAlteromonas espejiana) là một ví dụ của exonuclease. Enzyme này phân hủy cácnucleotide của cả hai sợi của phân tử mạch đôi.(Hình 4.2(a))Hình 4.2 . Phản ứng xúc tác của các loại exonuclease khác nhau.(a) Bal31 thủy phân nucleotide của cả hai mạch của phân tử mạch đôi.(b) Exonuclease III, từng nucleotide một từ đầu 3’.Thời gian để Bal31 phân hủy phân tử DNA càng nhiều, càng tạo ra nhiều đoạn DNAcó kích thước ngắn.Mặt khác, những enzyme như exonuclease III(E.coli) chỉ phânhủy một mạch của phân tử mạch đôi, sản phẩm tạo ra bao gồm cả phân tử mạch đơnkhông bị phân hủy.Việc phân loại endonuclease cũng theo cách trên.Endonuclease S1 (từ nấmAspergillus oryzae) chỉ phân hủy mạch đơn của phân tử DNA mạch đôi (Hình 4. ...