Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 5

Chuyển DNA vào trong tế bào sốngCHƯƠNG V: CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO SỐNGNhững thao tác được mô tả trong chương IV cho phép các nhà sinh học phân tử tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp mới. Bước tiếp theo trong thí nghiệm gene cloning là việc chuyển những phân tử này vào trong tế bào sống, thông thường là vi khuẩn, chúng đồng thời tăng trưởng và phân chia để sản xuất ra các clone (Hình 1.1). Nói một cách chính xác, “cloning” chỉ dùng cho các bước sau của phương pháp chứ không dùng cho...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 5Chuyển DNA vào trong tế bào sốngCHƯƠNG V: CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO SỐNGNhững thao tác được mô tả trong chương IV cho phép các nhà sinh học phân tử tạo ranhững phân tử DNA tái tổ hợp mới. Bước tiếp theo trong thí nghiệm gene cloning là việcchuyển những phân tử này vào trong tế bào sống, thông thường là vi khuẩn, chúng đồngthời tăng trưởng và phân chia để sản xuất ra các clone (Hình 1.1). Nói một cách chínhxác, “cloning” chỉ dùng cho các bước sau của phương pháp chứ không dùng cho việc tạochính phân tử DNA tái tổ hợp.Cloning phục vụ cho 2 mục đích, đầu tiên nó cho phép sản xuất được một số lượng lớnphân tử DNA tái tổ hợp từ một lượng giới hạn nguyên liệu ban đầu. Lúc đầu chỉ có sẵnmột lượng vài nanogram DNA tái tổ hợp, nhưng mỗi vi khuẩn mang một plasmid sẽ phânchia nhiều lần để tạo ra một khuẩn lạc (colony), mỗi tế bào lại chứa nhiều bản sao củaphân tử. Từ một khuẩn lạc thuần nhất có thể tạo ra vài microgram DNA tái tổ hợp, tượngtrưng cho sự nhân lên gấp hàng ngàn lần so với lượng ban đầu (hình 5.1). Nếu như vikhuẩn không được sử dụng như một nguồn DNA mà được sử dụng để nhân sinh khối thìlượng DNA tạo thành có thể đạt đến vài mg DNA tức là năng suất tăng lên gấp hàngtriệu lần. Bằng cách này, cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA cần thiết cho việcnghiên cứu sinh học phân tử vế cấu trúc và biểu hiện gen.Vai trò quan trọng thứ hai của cloning là được dùng trong quá trình tinh sạch. Nhữngthao tác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp hiếm khi được điều khiển tới mức độ mà không cómột phân tử DNA nào khác hiện diện khi kết thúc quá trình sản xuất. Việc gắn trộn có thểgồm, ngoài những phân tử tái tổ hợp mong muốn, còn có một số dạng sau: 1. Phân tử vectơ không đóng vòng (có bị cắt). 2. Những đoạn DNA mở (không gắn vào vectơ, có đoạn mang gen mong muốn hoặc không). 3. Phân tử vectơ tự đóng vòng mà không mang đoạn DNA mới được chèn (“self- ligated” vectơ). 4. Phân tử DNA tái tổ hợp có mang đoạn DNA bị chèn sai (không mang gen mong muốn). 1Chuyển DNA vào trong tế bào sốngHình 5.1: Cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA tái tổ hợpMột tế bào đơn chứa nhiều bản sao tái tổ hợpPhát triển thành 1 khuẩn lạc cung cấp vài µg DNA tái tổ hợpNuôi cấy trong 500 ml dịch lỏng, ủ trong 18hCung cấp vài mg DNA tái tổ hợp 2Chuyển DNA vào trong tế bào sốngNhững phân tử không đóng vòng hiếm khi bị ảnh hưởng bởi vì mặc dù tế bào vi khuẩncó thể mang chúng thì chỉ trong những trường hợp bất thường mới có thể nhân lên. Cónhiều khả năng là các enzyme trong tế bào chủ sẽ làm rã các mảnh DNA này. Mặt khác,phân tử “self-ligated” và những plasmid tái tổ hợp sai cũng có khả năng tái bản nhưnhững phân tử mong muốn (hình 5.2b). Tuy nhiên, việc tinh sạch chọn ra các phân tửmong muốn vẫn có thể đạt được qua cloning bởi việc bất cứ tế bào nào mang nhiều hơnmột phân tử DNA là hiện tượng rất bất thường. Mỗi tế bào phát triển thành một khuẩnlạc, vì vậy mỗi tế bào trong dòng tế bào thu được đều chứa cùng phân tử. Tất nhiên,những khuẩn lạc khác nhau chứa những phân tử khác nhau: một số chứa những phân tửDNA tái tổ hợp mong muốn, một số chứa những phân tử DNA tái tổ hợp khác và một sốchứa những vectơ “self-ligated”. Do đó, vấn đề đặt ra là làm sao xác định được khuẩn lạcchứa plasmid tái tổ hợp đúng.Hình 5.2: Cloning cũng tương tự như tinh sạch, từ một hỗn hợp nhiều loại phân tử khácnhau, có thể thu được các clone chỉ chứa các bản sao của một loại phân tử a. Sản phẩm của sự gắn kết đoạn DNA mở Phân tử vector tự đóng vòng Phân tử vector gen phân tử DNA tái tổ hợp không đóng vòng mong muốn Phân tử DNA tái tổ hợp sai b. Tất cả phân tử đóng vòng được clone (nhân dòng) Tế bào chứa vector tự đóng vòng tế bào chứa phân tử DNA tái tổ hợp sai Tế bào chứa phân tử mong muốn Clone của vector Clone mong mu ốn Clone của phân tử sai tự đóng vòng 3Chuyển DNA vào trong tế bào sốngChương này đưa ra cách plasmid và vectơ phage, phân tử tái tổ hợp thu nhận từ cáckhuẩn lạc trên các tế bào vi khuẩn. Xuyên suốt chương này, ta sẽ thấy việc chọn giữakhuẩn lạc chứa phân tử tái tổ hợp và khuẩn lạc chứa vectơ tự đóng vòng là tương đối dễdàng. Việc khó hơn là làm sao để phân biệt các clone chứa phân tử DNA tái tổ hợp đúngtrong tất cả những clone tái tổ hợp khác sẽ sẽ được đề cập trong chương VIII. ...