Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 6

Chương 6Chöông 6: CLONING VECTOR CHO E.COLINgaøy nay, nhöõng thí nghieäm cô baûn lieân quan ñeán vieäc taïo cloning gene ñöôïc quan taâm. Trong chöông 3,4 vaø 5 chuùng ta ñeà caäp ñeán vaán ñeà laøm theá naøo ñeå coù theå tinh saïch DNA töø phaàn chieát cuûa teá baøo? Laøm theá naøo ñeå phaân töû DNA taùi toå hôïp coù theå ñöôïc taïo ra trong oáng nghieäm? Laøm theá naøo ñeå phaân töû DNA coù theå ñöôïc chuyeån vaøo trong teá baøo soáng? Laøm theá naøo recombinant clones ñöôïc ñaët leân haøng ñaàu? ÔÛ chöông naøy chuùng ta seõ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 6Chương 6 Chöông 6: CLONING VECTOR CHO E.COLI Ngaøy nay, nhöõng thí nghieäm cô baûn lieân quan ñeán vieäc taïo cloning geneñöôïc quan taâm. Trong chöông 3,4 vaø 5 chuùng ta ñeà caäp ñeán vaán ñeà laøm theá naøoñeå coù theå tinh saïch DNA töø phaàn chieát cuûa teá baøo? Laøm theá naøo ñeå phaân töûDNA taùi toå hôïp coù theå ñöôïc taïo ra trong oáng nghieäm? Laøm theá naøo ñeå phaân töûDNA coù theå ñöôïc chuyeån vaøo trong teá baøo soáng? Laøm theá naøo recombinantclones ñöôïc ñaët leân haøng ñaàu?ÔÛ chöông naøy chuùng ta seõ tìm hieåu nhöõng cloning vector ñöôïc caùc nhaø SH phaântöû thöôøng duøng, tìm hieåu veà tính chaát, caùch söû duïng cuûa caùc loaïi cloning vector.Sự đa dạng lớn các lọai vector toàn taïi cuøng vôùi vieäc söû duïng E.Coli nhö laø sinhvaät chuû. Ñieàu naøy khoâng coù gì ngaïcnhieân bôûi vì vai troø chính cuûa vi khuaån ñaõ ñöôïc phaùt hieän trong nghieân cöùu côbaûn hôn 50 naêm qua. Nguoàn thoâng tin phong phuù veà vi sinh, sinh hoïc di truyeànveà E.Coli ñaõ ñoùng goùp vaøo haàu heát caùc nghieân cöùu chuû yeáu veà caáu truùc vaø chöùcnaêng cuûa gene, ñaõ ñöôïc ñöa vaøo vi khuaån naøy nhö laø sinh vaät thöïc nghieäm.Nhöõng naêm gaàn ñaây, vieäc nghieân cöùu taïo doøng gene vaø sinh hoïc phaân töû coù moáiquan heä laãn nhau – trôû thaønh 1 thaønh töïu quan troïng trong taïo doøng gen, ñaõ taùcñoäng kích thích nghieân cöùu. Nhu caàu cuûa vieäc nghieân cöùu thoâi thuùc vieäc phaùttrieån nhieàu cloning vector ngaøy caøng tinh vi vaø phöùc taïp hôn. Chöông naøy chuû yeáu ñeà caäp ñeán nhöõng loaïi cloning vector E.Coli quan troïngvaø coâng duïng ñaëc bieät cuûa chuùng. 6.1) Nhöõng vector taïo doøng döïa vaøo plasmid cuûa E.Coli: Nhöõng vector taïo doøng ñôn giaûn nhaát vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trongvieäc taïo doøng gene laø nhöõng plasmid cuûa vi khuaån nhoû. Moät soá löôïng lôùn vectorplasmid khaù nhau coù theå ñöôïc söû duïng vôùi E.Coli, có töø nhöõng nhaø cung caápthöông maïi. Chuùng laø söï keát hôïp cuûa vieäc deã daøng tinh saïch vaø ñaëc tính mongmuoán nhö laø hieäu quaû chuyeån gene cao, thuaän lôïi cho vieäc choïn löïa maker ñeåchuyeån gene vaø taùi toå hôïp vaø khaû naêng taïo doøng thích hôïp vôùi nhöõng DNA lôùn(leân ñeán 8kb). Haàu heát nhöõng thí nghieäm phoå bieán ñaõ söû duïng 1 hay nhieàu caùcloaïi vector plasmid khaùc nhau. Vector ñaàu tieân ñöôïc phaùt trieån vaø vaãn ñöôïc söû duïng phoå bieán ñeán ngaøy nay laøPBR322, ñaõ ñöôïc trình baøy ôû chöông 5. Ñeå minh hoaï cho nhöõng nguyeân taécchung cuûa vieäc choïn loïc bieán ñoåi vaø nhaän bieát söï taùi toå hôïp (Tr.95). Chuùng tabaét ñaàu nghieân cöùu plasmid vector E.Coli baèng vieäc tìm hieåu caën keõ PBR322. 6.1.1) Danh phaùp cuûa vector plasmid trong cloning: 1Chương 6 Teân “PBR322” tuaân thuû theo quy ñònh chuaån cho danh phaùp vector. “P” – chæ ra ñaây laø plasmid. “BR” – mieâu taû thí nghieäm nôi maø vector ñoù ñöôïc xaùc ñònh caáutruùc laàn ñaàu tieân (BR la vieát taéc cuûa 2 nhaø baùc hoïc Bolivar vaø Rodirge nhöõngngöôøi phaùt trieån PBR322 ). 322 – ñeå phaân bieät plasmid naøy vôùi nhöõng loaïi plasmid khaùc ñöôïctaïo ra trong cuøng 1 ñôït thí nghieäm (1 soá plasmid goïi laø PBR325, PBR327,PBR328,……). 6.1.2) Ñaëc tính coù lôïi cuûa PBR322: Baûn ñoà di truyeàn vaø tính chất vật lyù cuûa PBR322 giaûi thích taïi sao plasmidlaø 1vector taïo doøng phoå bieán. Ñaëc tính höõu duïng ñaàu tieân cuûa PBR322 laø veà kích côõ cuûa noù, ôû chöông 2noùi roõ raèng 1 vector taïo doøng phaûi nhoû hôn 10kb ñeå traùnh nhöõng vaán ñeà nhö laøDNA bò gaõy trong suoát quaù trình tinh saïch. PBR322 coù kích thöôùc laø 4363bp,đieàu ñoù coù nghóa laø noù khoâng chæ coù theå ñöôïc tinh saïch 1 caùch deã daøng maø noùcoøn coù theå xaây döïng ñöôïc phaân töû DNA taùi toå hôïp. Ngay caû khi theâm ñoaïn DNA6kb thì phaân töû PBR322 taùi toå hôïp vaãn coù kích thöôùc phuø hôïp. 2Chương 6 Ñaëc tröng thöù hai cuûa PBR322 ñöôïc ñeà caäp trong chöông 5, noù coù mang 2 vòtrí gen khaùng khaùng sinh,kháng ampiciline hoaëc tetracyline, coù theå ñöôïc söû duïngnhö laø 1 maker choïn loïc cho nhöõng teá baøo chöùa plasmid. Vaø moãi gen maker coù1vò trí caét duy nhaát duøng cho thí nghieäm cloning. Vieäc cheøn vaøo DNA môùi trongPBR322 ñöôïc caét bôûi PstI, PvuI hay Scal seõ baát hoaït gen ampR vaø söû duïng 1trong 8 loaïi enzyme endonuclease giôùi haïn (ñaùng chuù yù laø BamHI vaø HindIII)baát hoaït gen khaùng Tetracyline. Caùc vò trí caét ña daïng naøy coù theå ñöôïc söû duïngcho vieäc baát hoaït do xen ñoaïn, ñieàu ñoù coù nghóa là l PBR322 coù theå söû duïng ñeåcl ...