Giáo trình - công nghệ di truyền - chương 7

Chương 7 : Những vector cloning dành cho các loại tế bào chủ trừ E.coliHầu hết những thí nghiệm cloning được dùng E.coli làm tế bào chủ và nhiều loại vector phù hợp với vi khuẩn này. E.coli được sử dụng phổ biến khi thí nghiệm cloning nghiên cứu về những đặc điểm của sinh học phân tử như cấu trúc, chức năng gen. Tuy nhiên trong những trường hợp đặc biệt thì ta có thể sử dụng những tế bào chủ khác. Điều này có thể không giúp nghiên cứu gen nhưng ta có thể điều khiển hay cải...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình - công nghệ di truyền - chương 7Chương 7 : Những vector cloning dành cho các loạitế bào chủ trừ E.coli Hầu hết những thí nghiệm cloning được dùng E.coli làm tế bào chủ và nhiềuloại vector phù hợp với vi khuẩn này. E.coli được sử dụng phổ biến khi thí nghiệmcloning nghiên cứu về những đặc điểm của sinh học phân tử như cấu trúc, chứcnăng gen. Tuy nhiên trong những trường hợp đặc biệt thì ta có thể sử dụng những tếbào chủ khác. Điều này có thể không giúp nghiên cứu gen nhưng ta có thể điềukhiển hay cải thiện sự tổng hợp sản phẩm trao đổi chất (ví dụ như hormone insulin)hay thay đổi đặc tính của sinh vật (ví dụ nh ư việc đưa gen kháng thuốc diệt cỏ vàocây trồng). Do đó chúng ta cần quan tâm đến những vector cloning dành cho nhữngtế bào chủ khác ngoài E.coli. 7.1 Vector dành cho nấm men và những loài nấm khác Nấm men Saccharomyces cerevisiae là loài sinh vật quan trọng trong côngnghệ sinh học. Nấm men có vai trò trong sản xuất bia, bánh mì. Ngoài ra, nó cònđược sử dụng như vật chủ trong sản xuất các loại dược phẩm từ những gen đượcclone. Việc khám phá ra một loại plasmid tồn tại trong hầu hết các chủng nấm menS.cerevisiae đã thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển của những dòng vector cloning dànhcho nấm men (hình 7.1). Plasmid là một vòng có kích thước 2 µm, là một trongnhững plasmid có số lượng giới hạn chỉ tìm thấy trong tế bào eukaryote.Hình 7.1 : Plasmid 2 µm của nấm men, REP1 và REP2 phải có trong bản sao củaplasmid và FLP mã hóa protein mà có thể biến đổi từ dạng A sang dạng B củaplasmid. Tại FLP, trình tự gen được sắp xếp lại bằng sự tái tổ hợp nội phân tử.Chức năng của vùng D chưa được biết chính xác.7.1.1 Marker chọn lọc cho plasmid 2 µm: Vòng 2 µm phù hợp là vector cloning: kích thước 6 kb, tồn tại trong tế bàonấm men với số lượng copy khoảng 70-200. Việc nhân đôi plasmid yêu cầu một sốyếu tố tham gia: ori trên plasmid, vài enzyme được cung cấp từ tế bào chủ, cácprotein được mã hóa từ gen REP1 và REP2 nằm trên plasmid. Tuy nhiên, plasmid 2 µm làm vector cloning không phải là hoàn toàn hoànhảo. Vấn đề đầu tiên là marker chọn lọc. Những vector cloning nấm men gần đâymang gen kháng các chất ức chế như methotrexate và copper nhưng hầu hết vectorphổ biến sử dụng các loại khác của của hệ thống chọn lọc. Thực tế những gen nấmmen bình thường được sử dụng để mã hóa cho enzyme cần trong sự tổng hợp aminoacid. Ví dụ: gen LEU2 mã hóa β-isopropyl malate dehydrogenase, đây là enzymecần trong sự chuyển hóa acid pyruvic thành leucine. Để sử dụng LEU2 như marker chọn lọc thì tế bào chủ là đột biến dị dưỡng.Tế bào chủ này có gen LEU2 bất hoạt. Nấm men leu2 không thể tổng hợp leucine vàchỉ có thể tồn tại nếu amino acid này có trong môi trường dinh dưỡng (hình 7.2 (a)).Sự chọn lọc có thể vì sự tái tổ hợp chứa bản sao plasmid chứa gen LEU2 và có thểphát triển khi thiếu amino acid. Trong thí nghiệm cloning, tế bào được cấy trên môitrường thiếu amino acid; và chỉ những tế bào tái tổ hợp mới sống và tạo khuẩn lạc(hình 7.2 (b)).Hình 7.2 Sử dụng gen LEU2 như merker chọn lọc trong thí nghiệm cloning với nấmmen.7.1.2 Vector dựa trên vòng 2 µm – yeast episomal plasmid (YEps) Những vector được chế tạo từ plasmid 2 µm được gọi là YEps. Một số YEpschứa phân tử plasmid 2 µm hoàn chỉnh, một số khác chỉ sử dụng điểm ori củaplasmid 2 µm. Ví dụ: YEp13 (hình 7.3).Hình 7.3 Plasmid episomal của nấm men – YEp13 YEp13 thể hiện vài đặc điểm của vector cloning nấm men. Đầu tiên, nó làmột shuttle vector gồm: a) Thành phần lấy từ plasmid 2 µm: điểm ori và gen LEU2làm marker chọn lọc. b) Trình tự hoàn chỉnh của dòng vector pBR322. Cho nên,YEp13 có khả năng sao chép và chọn lọc trong tế bào nấm men hay E.coli. Shuttlevector gặp khó khăn khi thu hồi phân tử DNA tái tổ hợp từ khuẩn lạc nấm men đãbiến nạp, do khi shuttle vector đ ược biến nạp vào tế bào nấm men, nó sẽ tích hợpvào một trong những sợi NST trong nhân nấm men. Cho nên tinh sạch mẫu DNAcloning ra khỏi chromosome là một công việc khó khăn và đây cũng là trở ngại lớncho những thí nghiệm cloning có sử dụng bước đọc trình tự DNA. Nhưng khó khăntrên không xảy ra khi sử dụng vector YEps vì YEps tồn tại độc lập với nhân trong tếbào nấm men. Quy trình chuẩn được sử dụng để cloning trong nấm men là: B1: Tạo và sàn lọc DNA tái tổ hợp sẽ được thực hiện trong E.coli. B2: Tinh khiết và xác định đặc tính phân tử DNA cần cloning. B3: Phân tử DNA mục tiêu được đưa vào tế bào nấm men. (hình 7.4).Hình 7.4 Cloning với vector E.coli-yeast shuttle cụ thể là YEp13.7.1.3 Đưa YEp vào DNA của nấm men Thuật ngữ “episomal” nói lên rằng YEp có thể sao chép độc lập với nhân vàcó thể tích hợp vào nhiễm sắc thể trong nhân của nấm men. Hiện tượng tích hợp xảyra vì trên vector có mang những gen làm marker chọn lọc tương đồng chặt chẽ vớicác phiên bản của nó nằm trong DNA nhiễm sắc thể nấm men. Ví dụ với YEp13, sựtái tổ hợp ...