Giáo trình enzyme học - Chương 2

Tham khảo tài liệu giáo trình enzyme học - chương 2, khoa học tự nhiên, công nghệ sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình enzyme học - Chương 2 19Chương 2 Phương pháp nghiên cứu enzyme Có hai loại phương pháp dùng để nghiên cứu các phản ứngenzyme. Một trong hai phương pháp đó là lựa chọn các mẫu sau nhữngthời gian nhất định và đo sự biến đổi của phản ứng enzyme. Qua hàng loạtđiểm riêng biệt nhận được sẽ xây dựng được đường biểu diễn của cácbước phản ứng. Phương pháp khác là tiến hành quan sát bản thân hỗn hợpphản ứng theo tiến trình xảy ra và có thể xây dựng được một số lớnnhững thay đổi, hoặc dựa vào các phương pháp tự động để ghi lại.Chúng ta sẽ nhận được những đường biểu diễn liên tục các bước pháttriển của phản ứng enzyme. Ở phương pháp đầu, người ta thường đo nồng độ cơ chất hoặcnồng độ sản phẩm của phản ứng. Nếu phản ứng tăng thi cả hai cách vừanêu ở trên có thể được sử dụng để đo hoạt động của enzyme. Trong mỗi trường hợp xác định tốc độ, người ta phải nhận được ítnhất là 3 điểm: một điểm ở thời điểm không, điểm thứ hai ở khoảng thờigian nhất định đã trôi qua, điểm thứ 3 ở khoảng thời gian lớn gấp hai lầnkhoảng trước. Từ đó có thể kiểm tra được sự đúng đắn của phản ứngenzyme trong khoảng thời gian quan sát. Nói chung, phần lớn các phương pháp được sử dụng để nghiên cứucác phản ứng enzyme là loại phương pháp nghiên cứu liên tục vì nó đượcmọi người ưa dùng hơn.2.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme Như phần đầu đã nói đến, enzyme là những chất xúc tác sinh họccó bản chất protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi,chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến tính (denaturation) và bị mấthoạt độ. Do đó, khi làm việc với enzyme, phải luôn luôn chú ý tránhnhững điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó. Thông thường phần lớn cáce nzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trungt ính (pH = 7 ± 2 ). Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gâyb iến tính enzyme. Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân... và các điềukiện về nhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme. Đặc biệt là khitách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Nhiệt độ thường 20dùng cho các công việc này thông thường từ 0 0C đến 50C. Đối với cácenzyme không bền, các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệtđộ thấp hơn (từ - 50C đến - 200C). Trong các trường hợp này, người ta haysử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muốiNaCl, hoặc thậm chí người ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acidđậm đặc... Ví dụ về một số hỗn hợp làm lạnh đã được trình bày trên bảng 2.1. Bảng 2.1. Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được - 21,30C Nước đá: muối 100:33 (3:1) - 20,00C Nước đá: H2SO4 đậm đặc 100: 25 (4:1) Như trên đã nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch cópH < 5 hoặc pH > 9, tuy rằng có một số ngoại lệ như pepsin bền trongacid. Do đó, tùy thuộc mỗi loại enzyme, song nên chú ý tránh pH quá acidhoặc quá kiềm. Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cầnphải thêm từ từ và rất thận trọng các acid hoặc kiềm. Và khi thêm hóa chấtđể điều chỉnh pH thì nên tiến hành ở 00C. Khi làm việc với enzyme cũngcần chú ý tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) ở mặtphân cách hai pha nước và khí. Để tránh việc tạo bọt có thể xảy ra, ngườita thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không đượclắc. Có khi việc tách từng phần enzyme bằng bột dễ làm mất hoạt tínhenzyme. Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêmammonium sulfate dưới dạng dung dịch bão hòa của nó. Trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ cácmẫu thực vật và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng...) khôngdùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đã han rỉ để tránh tác dụng của cácion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe...) mà dùng dụng cụ inox.. Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủaenzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Tách kết tủa enzyme bằng cách lytâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn. Ở một số trường hợp,khi tách và làm sạch enzyme có hiện tượng giảm dần hoạt độ, vì vậy cầnphải làm thí nghiệm nhanh. Tốt nhất là thực hiện thí nghiệm liên tục,không ngắt quảng. Ví dụ tách chiết các enzyme chống oxy hóa(antioxidant enzyme) ở ty thể trong vòng 6h và đo luôn nếu không thì mấthoạt tính. Còn ở m icrosome thì tiến trình có thể kéo dài hơn vẫn 21k hông ảnh hưởng đến hoạt độ các enzyme chống oxy hóa và cáce nzyme oxy hóa khử. Một điều cần chú ý nữa là trong khi tiến hành xác định hoạt độ củacác enzyme, ...