Giáo trình Enzyme - Phần 15 & 16

Làm thế nào để tách chiết và sau đó tinh chế enzyme từ một vật liệu sinh học? Giai đoạn đầu của quá trình tách chiết enzyme là thu nhận dịch chiết từ một vật liệu sinh học nghiền nát sơ bô nào đó – bột, mầm thóc, hạt nẩy mầm, một mô động vật nào đó, một sinh khối vi khuẩn hoặc nấm ... Trong dịch chiết này đương nhiên có chứa protein và enzyme. Trong việc nghiên cứu enzyme người ta thường hay sử dụng dịch nghiền nát đồng thể. Để thu nhận loại dịch này khối...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình Enzyme - Phần 15 & 16 - 60 -EnzymeXV. TAÙCH CHIEÁT VAØ TINH CHEÁ ENZYME. Laøm theá naøo ñeå taùch chieát vaø sau ñoù tinh cheá enzyme töø moät vaät lieäusinh hoïc? Giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình taùch chieát enzyme laø thu nhaän dòchchieát töø moät vaät lieäu sinh hoïc nghieàn naùt sô boâ naøo ñoù – boät, maàm thoùc, haïtnaåy maàm, moät moâ ñoäng vaät naøo ñoù, moät sinh khoái vi khuaån hoaëc naám ...Trong dòch chieát naøy ñöông nhieân coù chöùa protein vaø enzyme. Trong vieäc nghieân cöùu enzyme ngöôøi ta thöôøng hay söû duïng dòchnghieàn naùt ñoàng theå. Ñeå thu nhaän loaïi dòch naøy khoái vaät lieäu sinh hoïc ñöôïcröûa saïch vaø nghieàn trong coái hoaëc trong moät thieát bò chuyeân duïng coù teân goïilaø maùy nghieàn. Trong khi nghieàn ngöôøi ta theâm nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm vaøkính ngieàn naùt ñeå giuùp phaù vôõ teá baøo. Saûn phaåm thu ñöôïc sau khi nghieànñöôïc goïi chung laø dòch ñoàng theå. Trong khoái dòch naøy chöùa caùc maûnh teá baøo,nhaân, luïc laïp cuûa laù, ty theå vaø caùc boä phaän khaùc cuûa teá baøo nhö saéc toá,protein hoøa tan v.v... Nghieàn naùt teá baøo trong nöôùc hoaëc trong dung dòch ñeäm coøn coù theå ñöôïcthöïc hieän baèng caùch taùc ñoäng leân chuùng baèng sieâu aâm trong moät thieát bò ñaëcbieät goïi laø maùy nghieàn sieâu aâm. Phöông phaùp naøy ngaøy nay ñöôïc söû duïng raátroäng raõi, ñaëc bieät, ñeå phaù vôõ teá baøo vi khuaån. Tuy nhieân khi söû duïng thieát bònaøy caàn phaûi choïn cheá ñoä laøm vieäc sao cho enzyme khoâng bò maát hoaït tính. Dòch nghieàn teá baøo sau ñoù coù theå ñöôïc ly taâm phaân ñoaïn ôû caùc toác ñoätaêng daàn khaùc nhau. Ví duï, coù theå baét ñaàu ly taâm ôû 1500 g, töùc ôû gia toác caohôn gia toác cuûa troïng löïc 1500 laàn. Sau khi taùch ñöôïc caùc tieåu phaàn laéng ñoïcxuoáng ñaùy oáng nghieäm laïi tieáp tuïc ly taâm ôû 20.000 g, 40.000 g v.v... ÔÛ 1500 g chloroplast reõ laéng xuoáng ñaùy, ôû 20.000 g ñeán phieân laéngñoïng cuûa ty theå; ôû 40.000 g hoaëc gia toác cao hôn seõ laéng ñoïng nhöõng haït nhoûhôn. Ñeå giöõ cho caùc cô quan töû cuûa teá baøo (ty theå, nhaân v.v... coø nguyeân veïnkhi ngieàn teá baøo thöïc vaät ñeå ly taâm thöôøng caàn theâm vaøo khoái vaät lieäu caànnghieàn 5 – 8% saccharose. Neáu duøng caùch naøy ñeå taùch khoûi vaät lieäu moät phaân ñoaïn caáu truùc döôùi teábaøo naøo ñoù (luïc laïp, ty theå v.v...) thì enzyme chöùa trong chuùng coù theå coønnaèm trong phaân ñoaïn ñoù ôû daïng lieân keát. Ñeå taùch chieát töø chuùng vaø chuyeånnhöõng enzyme ñoù sang daïng dung dòch thì caàn phaûi phaù vôõ caùc caáu truùc döôùiteá baøo ñoù. Ñeå laøm coâng vieäc naøy ngöôøi ta thöôøng duøng caùc chaát taåy röûadetergent voán laø nhöõng chaát coù hoaït tính beà maët raát cao. Neáu ñöôïc theâm vaøodòch nghieàn sinh khoái moät löôïng raát nhoû chuùng seõ laøm phaù vôõ caùc caáu truùc teábaøo vaø döôùi teá baøo. Thöôøng hay duøng nhaát laø twin (teân thöông maïi cuûa hoãnhôïp sorbit vaø caùc acid beùo phaân töû lôùn) hay desoxycholate.GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc - 61 -Enzyme Moät phöông phaùp khaùc thöôøng duøng ñeå taùch chieát enzyme khoûi caùc caáutruùc döôùi teá baøo laø lieân tuïc laøm ñoùng baêng vaø cho tan baêng phaân ñoaïn caáutruùc döôùi teá baøo caàn nghieân cöùu vaø sau ñoù tieán haønh ly taâm phaân ñoaïn. Ñeå thu nhaän caùc enzyme trong caùc dòch chieát hoaëc töø caùc phaân ñoaïndöôùi teá baøo coù theå duøng nöôùc, dung dòch ñeäm, dung dòch muoái (ví duï NaCl10%) hoãn hôïp glycerine vôùi nöôùc (ví duï 40% glycerine vaø 60% nöôùc) hoaëcdung moâi höõu cô (ví duï acetone). Ñeå taùch chieát nhieàu enzyme ngöôøi ta coøn duøng “boät acetone”. Nhöõngneùt cô baûn cuûa phöông phaùp naøy nhö sau: khi nghieàn moät maãu vaät naøo ñoù, víduï haït naåy maàm, cho theâm vaøo dòch nghieàn vaøi laàn acetone laïnh ñeå loaïi boûcaùc chaát coù baûn chaát lipid, moät soá chaát nhöïa , chaát coù maøu. Sau khi ñeå khoâthu ñöôïc moät loaïi boät ñoàng nhaát. sau khi chieát xuaát baèng dung dòch ñeämhoaëc baèng moät dung moâi naøo ñoù seõ thu ñöôïc dòch chieát chöùa caùc enzymequan taâm. Ñaùng tieác laø phöông phaùp naøy khoâng söû duïng ñöôïc cho taát caûenzyme vì moät soá enzyme bò maát hoaït tính trong acetone Laøm theá naøo taùch ñöôïc moät enzyme maø ta quan taâm töø dòch chieát baèngnöôùc hoaëc baèng dung dòch muoái? Coù nhieàu phöông phaùp khaùc nhau ñeå thöïchieän coâng vieäc naøy. Coå ñieån nhaát laø phöông phaùp keát tuûa protein enzyme amylase töø maàmluùa maïch baèng ethanol hoaëc acetone ñaõ ñöôïc A. Payen vaø J. Perco thöïc hieäntöø ñaàu theá kyû 20. Phöông phaùp naøy ngaøy nay ñöôïc söû duïng khaù roäng raõi. ñaëcbieät laø ñeå thu nhaän ...