Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 3

CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi. III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH III.1.1....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 3 CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi. III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH III.1.1. Nguyên lý Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù hợp với kháng thể. Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro. Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack, 1934) (hình 3.1). 34 Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau: - Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị. - Kháng nguyên đa hóa trị - Kháng nguyên phải hòa tan và thành phần của môi trường như lực ion hay pH có vai trò nhất định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa. - Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid là những chất gây tủa tốt nhất, còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan và ít kết tủa hơn. - Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ kết tủa III.1.2. Ứng dụng Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong mẫu huyết thanh hay huyết tương bằng cách định tính hay định lượng. III.1.3. Mẫu phân tích Mẫu huyết thanh hay huyết tương. III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng Phương pháp Heideiberger và Kendall Phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không, đó là do thay đổi tỷ lệ nồng độ tương đối giữa kháng thể và kháng nguyên. Trong một loạt ống thí nghiệm, cho đều cùng một lượng kháng thể không thay đổi. Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần. Kết quả là hiện tượng kết tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình 3.2). Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống. Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể bị tủa. Nếu lấy ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể có trong huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng thể đã bị tủa. Hơn nữa, nếu biết được lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên và kháng thể thì người ta có thể tính ra công thức của phức hợp Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép xác định được 3 khu vực: 35 - Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể. - Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép hình thành mạng lưới 3 chiều. - Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tối ưu cho phép tủa gần hết các phân tử kháng thể và kháng nguyên. Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng Định lượng bằng đo độ đục Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định lượng có giá trị cao. Kỹ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM…và trong việc tìm các kháng kháng thể. 36 III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel Nguyên lý Kháng thể cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau thì gây tủa, tủa ấy không di chuyển và hiện lên trông thấy bằng mắt thường hoặc nhuộm. Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Trong một lớp thạch không dày, đục thủng suốt những lỗ cách đều nhau, khoảng cách này phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của từng chất phản ứng. Rồi nhỏ vào trong mỗi lỗ đối diện với nhau một dung dịch kháng nguyên và kháng thể. Thời gian xuất hiện các đường cung tủa có thể là hai ngày đến một tuần. Hình 3.3. Khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Kỹ thuật này dù ít nhạy nhưng cho phép phân tích các hệ thống kháng nguyên- kháng thể. Muốn so sánh giữa hai kháng nguyên hay để phát hiện sự có mặt của nhiều kháng thể trong một huyết thanh thì có thể bố trí hai lô kháng nguyên trước một lỗ có chứa huyết thanh. Kết quả có thể: (i) Phản ứng giống hệt khi hai kháng nguyên y hệt nhau hay có epitop tương tự thì các đường kết tủa với kháng thể sẽ nối liền nhau; (ii) Phản ứng không y hệt ...