Hoàn thiện yếu tố kỹ thuật của xét nghiệm tìm đột biến mất đoạn vùng AZFa, AZFb và AZFc nhiễm sắc thể Y

Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y đã được xác định có liên quan đến tình trạng rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng. Nghiên cứu với mục tiêu hoàn thiện kỹ thuật xét nghiệm phát hiện loại đột biến này. Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Hoàn thiện yếu tố kỹ thuật của xét nghiệm tìm đột biến mất đoạn vùng AZFa, AZFb và AZFc nhiễm sắc thể YY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011Nghiên cứu Y họcHOÀN THIỆN YẾU TỐ KỸ THUẬT CỦA XÉT NGHIỆM TÌM ĐỘT BIẾNMẤT ĐOẠN VÙNG AZFa, AZFb VÀ AZFc NHIỄM SẮC THỂ YNguyễn Minh Hà*TÓM TẮTMở đầu : Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y đã được xác định có liên quan đến tìnhtrạng rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng.Mục tiêu : Hoàn thiện kỹ thuật xét nghiệm phát hiện loại đột biến này.Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu : Thử nghiệm một số yếu tố kỹ thuật của xét nghiệm : chọnloại enzyme Taq polymerase phù hợp, xác định độ nhạy của multiplex PCR mix.Kết quả : HotStart Taq DNA Polymerase của Qiagen® là enzyme tối ưu cho kỹ thuật nhưng ThermoTaq Polymerase của ABgene® vẫn cho kết quả vẫn chấp nhận được. Độ nhạy của MPCR mix được xácđịnh là 5ng DNA/µl trong khi nồng độ DNA tốt nhất cho phản ứng là 20ng/µl.Kết luận : Đã xác định thành công một số điều kiện kỹ thuật của xét nghiệm, hy vọng kết quả trên sẽgiúp ích cho các nghiên cứu tiếp theo khảo sát loại đột biến này.Từ khóa : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor)ASTRACTOPTIMIZATION OF TECHNICAL CONDITIONS FOR THE TEST OF AZFa, AZFb AND AZFcMICRODELETIONNguyen Minh Ha * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 – 2011: 23 - 26Background : Microdeletions in the AZF regions of the Y chromosome are defined to be related toabnormal spermatogenesis and sperm maturation arrest.Objectives : This study was carried-out in order to optimize some technical conditions of the AZFmicrodeletion test.Method : we test some technical conditions of the test : choosing the siutable DNA Taq Polymerase,defining the sensitivity of the multiplex PCR mix.Results : We suggest that HotStart Taq DNA Polymerase (Qiagen®) is the best enzyme for this test.However, the result of multiplex PCR with Thermo Taq Polymerase (ABgene®) is also good. The sensitivityof the multiplex PCR mix is 5ng DNA/µl while the optimal DNA concentration is 20ng/µl.Conclusion : We have defined some technical conditions of this test and we hope that these results willbe useful for next researches about this mutation.Keywords : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor)*Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tp. Hồ Chí MinhĐT: 0989 21 23 82Địa chỉ liên hệ: ThS. Nguyễn Minh HàChuyên Đề Khoa học Cơ bảnEmail: drnguyenminhha@gmail.com23Nghiên cứu Y họcY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨUTrước đây vô sinh thường được cho là dongười vợ. Tuy nhiên khi các khảo sát trên namgiới được đẩy mạnh thì có 35-40% nguyênnhân vô sinh là do người chồng, trong đókhoảng 90% có liên quan đến các bất thườngsinh tinh (2). Các đột biến mất đoạn vùng AZFcủa nhiễm sắc thể Y, được tác giả Tiepolo vàZuffardi báo cáo lần đầu tiên năm 1976, cóliên quan đến sự rối loạn sinh tinh và giánđoạn trưởng thành tinh trùng do đó làm giảmmạnh khả năng có con (4). Đứng trước nhu cầucần có một công cụ khảo sát loại rối loạn ditruyền này, chúng tôi tiến hành nghiên cứunhằm hoàn thiện các yếu tố kỹ thuật của xétnghiệm tìm đột biến vùng AZFa, b và c trênnhiễm sắc thể Y.ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNHLấy 3mL máu ngoại biên chống đông bằngEDTA. Ly trích DNA bộ gen từ tế bào bạchcầu với tỷ số tinh khiết từ 1,8 – 2,0.Mỗi mẫu DNA được chạy 2 phản ứngMultiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứngkhuếch đại 5 đoạn DNA (gồm 2 đoạn genZFY, SRY là chứng nội tại và 3 đoạn genthuộc 3 vùng AZFa, b, c). Các cặp mồi sửdụng phát hiện được 95% trường hợp mấtđoạn trên vùng AZF (3). Chứng nam, chứng nữ(DNA của một người nam và người nữ bìnhthường) và chứng nước được chạy song songvới mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Lần lượt thayđổi các loại Taq DNA polymerase (HotStartTaq polymerase của Qiagen®, Thermo TaqcủaABgene®,TaqpolymerasecủaPromega®) với lượng không đổi là 2u/50 μlphản ứng để xác định được loại enzyme tốiưu cho phản ứng. Nồng độ trong một phảnứng của Mg2+ là 6.5mM, của mồi là 2µmol mỗiloại và của dNTPs là 0,3mM. Chu kỳ nhiệtphản ứng là 950C 6’ , 940C 30’’ , 550C 30’’, 720C60’’ , 35 chu kỳ, 720C 10’. Sản phẩm PCR đượcchạy điện di ở 100V trong 40 phút trên gelagarose 2,5%, với chất phát quang ethidium24bromide và thước đo 100 đôi base. Đọc kếtquả dưới đèn UV và chụp hình lưu lại (3).Bảng 1: Các đoạn gen được khuếch đại trongphần phản ứngĐoạn khuếch đại Kích thước(đôi base)Phản ứng1Phản ứng2ZFY ( chứng )SRY (chứng )sY86 ( AZFa )sY127 ( AZFb )sY254 (AZFc)ZFY ( chứng )SRY (chứng )sY84 ( AZFa )sY134 ( AZFb )sY255 (AZFc)495472320274380495472326301126Xác định độ nhạy của MPCR mix bằng cáchpha loãng liên tiếp DNA đã biết trước nồng độcủa một người nam bình thường (không vôsinh, tinh trùng đồ bình thường, đã làm xétnghiệm không bị đột biến tại vùng AZF) vớinước cất, bắt đầu từ 20 ng/μl (1,3). Các DNA phaloãng này sẽ được cho vào P ...