KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 4

LAI PHÂN TỬ 1. ĐÁNH DẤU MẪU DÒ DNA, RNA, OLIGONUCLEOTIDE 2. CÁC KIỂU LAI Lai trong pha lỏng Lai trên pha rắn (Southern, Northern, dot blot) Lai tại chỗ 3. ỨNG DỤNG CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC Có ái lực với antiDigoxigenin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có ái lực với streptavidin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN Đánh dấu mẫu dò (probe) Lai với trình tự mục tiêu thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang Phát hiện phân tử lai PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION “Đục lỗ” trên 2 mạch của DNA bằng Dnase I...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 4 LAI PHAÂN TÖÛ 1. ÑAÙNH DAÁU MAÃU DOØ DNA, RNA, OLIGONUCLEOTIDE 2. CAÙC KIEÅU LAI Lai trong pha loûng Lai treân pha raén (Southern, Northern, dot blot) Lai taïi choã 3. ÖÙNG DUÏNG CAÙC PHAÂN TÖÛ DUØNG ÑAÙNH DAÁU HOAÙ HOÏC Coù aùi löïc vôùi anti- Digoxigenin Duøng phoái hôïp vôùi dATP, dCTP, dGTP, dTTP Coù aùi löïc vôùi streptavidin Duøng phoái hôïp vôùi dATP, dCTP, dGTP, dTTP ÑAÙNH DAÁU BAÈNG BIOTIN Ñaùnh daáu maãu doø (probe) Lai vôùi trình töï muïc tieâu Phaùt hieän phaân töû lai thoâng qua phöùc hôïp avidin/chaát phaùt huyønh quang PHÖÔNG PHAÙP NICK TRANSLATION “Ñuïc loã” treân 2 maïch cuûa DNA baèng Dnase I DNA polymerase I söû duïng haoït tính 5’-3’ exonuclease “gaëm” maïch DNA theo chieàu 5’-3’ DNA polymerase I vöøa thuûy phaân vöøa toång hôïp maïch môùi buø vaøo loã troáng vôùi caùc dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP ñaùnh daáu) Keát quaû laø probe ñöôïc ñaùnh daáu PHÖÔNG PHAÙP RANDOM PRIMING Bieán tính maïch ñoâi DNA Baét caëp toå hôïp “ moài“ ngaãu nhieân treân 2 maïch 64 = 1296 primers DNA polymerase toång hôïp buø vaøo choã troáng baèng caùc dNTP trong ñoù coù nucleotide ñaùnh daáu Keát quaû laø probe ñaùnh daáu PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU OLIGONUCLEOTIDE PHAÛN ÖÙNG PHOSPHATASE PHAÛN ÖÙNG KINASE PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU OLIGONUCLEOTIDE SÖÛ DUÏNG TERMINAL TRANSFERASE TOÅNG HÔÏP MAÃU DOØ RNA BAÈNG PHIEÂN MAÕ IN VITRO Trình töï seõ duøng laøm probe ñöôïc taïo doøng vaøo vector bieåu hieän Tuøy maïch muoán duøng laøm probe seõ söû duïng promoter töông öùng RNA polymerase nhaän bieát promoter ñaëc hieäu, gaén vaøo vaø toång hôïp RNA Nucleotide töï do duøng trong quaù trình phieân maõ coù mang moät phaàn nucleotide ñaùnh daáu Keát quaû laø maãu doø RNA ñaùnh daáu (riboprobe) TOÅNG HÔÏP MAÃU DOØ RNA BAÈNG PCR VAØ PHIEÂN MAÕ IN VITRO gene A T7 promoter PCR Phieân maõ in vitro vôùi T7 RNA polymerase Maãu doø RNA Thay vì taïo doøng thì söû duïng PCR ñeå gaén theâm trình töï promoter phuø hôïp Quaù trình tieáp theo gioáng nhö taïo doøng SOUTHERN BLOT SOUTHERN BLOT (tieáp) Taùch chieát & caét DNA baèng enzyme giôùi haïn Ñieän di Chuyeån leân maøng lai Lai vaø phaùt hieän phaân töû lai Bieán tính DNA Tieàn lai LAI TREÂN PHA RAÉN & PHAÙT HIEÄN PHAÂN TÖÛ LAI BAÈNG ÑOÀNG VÒ PHOÙNG XAÏ Coá ñònh DNA leân maøng lai Lai vôùi maãu doø ñaùnh daáu phoùng xaï Röûa maøng lai Thöïc hieän phoùng xaï töï ghi SOUTHERN - NORTHERN BLOT KEÁT QUAÛ NORTHERN BLOT Ghi chuù : UN : Maãu chöùng khoân caûm öùng, 48h : maãu caûm öùng taïo -globin sau 48 giôø, 96h : maãu caûm öùng taïo -globin sau 96 giôø. Maãu doø ñoàng vò phoùng xaï DOT BLOT Taùch chieát DNA, RNA Bieán tính (neáu coù) Ñaët leân maøng lai Tieàn lai Lai vôùi maãu doø (trình töï ñaõ bieát) Phaùt hieän phaân töû lai Duøng ñeå phaùt hieän, hoaëc ñònh löôïng töông ñoái khi so vôùi thang haøm löôïng ñaõ bieát Phöông phaùp caûi bieân laø reverse dot blot. Trình töï ñaõ bieát ñöôïc coá ñònh treân giaù theå coøn trình töï caàn bieát (muïc tieâu) ñöôïc ñaùnh daáu WESTERN BLOT Ñieän di treân Chuyeån leân Lieân keát vôùi khaùng theå 1 & Phaùt hieän maøu gel maøng lai 2. Röûa ñeå loaïi khaùng theå thoâng qua phaûn öùng polyacrylamide thöøa enzyme CAÉT MAÃU CHO LAI “TAÏI CHOÔ (IN SITU HYBRIDIZATION) KEÁT QUAÛ LAI TREÂN NHIEÃM SAÉC THEÅ LAI “TAÏI CHOÔ TREÂN PHOÂI Coá ñònh maãu (formol, ñoâng laïnh) Caét laùt moûng (microtome) Coá ñònh treân lam kính Xöû lyù maãu tröôùc khi lai Tieàn lai Lai vôùi maãu doø ñaùnh daáu hoùa hoïc hay ño ...