KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 6

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR1. Primer (mồi) Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2) Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại. 2. DNA bản mẫu (template) Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ..), heparin, ..) 3. Nồng độ MgCl2 Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 6PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR1. Primer (moài) Moài phaûi thoûa moät soá ñieàu kieän cô baûn : (1) daøi khoaûng 18-24 base, (2) Tm cuûa 2 primer gaàn nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) khoâng hình thaønh primer dimer, (5) khoâng phaûi laø trình töï laëp laïi.2. DNA baûn maãu (template) Haøm löôïng ñuû nhöng khoâng quaù cao, tinh saïch – khoâng chöùa caùc chaát öùc cheá phaûn öùng (SDS, chaát öùc cheá töø maãu (hemoglobin, saéc toá, ..), heparin, ..)3. Noàng ñoä MgCl2 Caàn cho hoaït ñoäng cuûa Taq polymerase ; haøm löôïng quaù cao seõ taïo nhieàu saûn phaåm kyù sinh, quaù thaáp thì laøm giaûm hieäu quaû nhaân baûn cuûa enzyme4. dNTP Thaønh phaàn 4 loaïi dNTP phaûi caân baèng ; haøm löôïng thöôøng khoâng ñoåi nhöng coù theå thay ñoåi tuøy ñieàu kieän thöïc teáCAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR (tieáp)5. Enzyme Ñöôïc choïn tuøy muïc ñích söû duïng : Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thoâng duïng nhaát, hoaït tínhpolymerase khaù maïnh (35-100 nu/giaây), coù hoaït tính 5’3’ exonuclease Stoffel DNA polymerase : tính chòu nhieät cao hôn, khoâng coù hoaït tính 5’-3’exonuclease, hoaït ñoäng ñöôïc ôû phoå MgCl2 roäng multiplex PCR Taq vaø Stoffel DNA polymerase theâm 1 3’dA vaøo saûn phaåm PCR Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chòu nhieätraát cao, nhaân baûn ñöôïc nhöõng ñoïan DNA raát daøi, coù hoaït tính 3’-5’exonuclease tính trung thöïc cao hôn Taq pol 5-15 laàn, taïo saûn phaåm “ñaàubaèng” Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : coù caû 2 hoaït tính 5’-3’ vaø3’-5’ exonuclease, tính trung thöïc cao hôn Taq pol 12 laàn, thöôøng duøng trongcycle sequencing Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vöøa coù chöùc naêngpolymerase vöøa coù chöùc naêng phieân maõ ngöôïc (RT) duøng trong phaûn öngRT-PCR UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chòu nhieät raát cao,coù hoaït tính 3’-5’ exonuclease tính trung thöïc raát caoCAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR (tieáp)5. Chöông trình PCR : Nhieät ñoä : bieán tính – 94-95 C ; lai < Tm cuûa caùc primer ~ 5 C ; keùodaøi - 72 C Thôøi gian cuûa töøng chu kyø tuøy thuoäc thieát bò vaø kích thöôùc saûn phaåm Soá löôïng chu kyø thöôøng 40 Ví duï : 1 chu kyø - 95 C – 5‘ 35 chu kyø – 94 C – 30” 55 C – 30” 72 C – 45” 1 chu kyø – 72 C – 10’6. Thieát bò : Nhöõng caûi tieán maùy luaân nhieät lieân quan ñeán (1) microtiter plate96 gieáng, (2) caùc block nhieät rieâng bieät trong 1 maùy, (3) block duøng cho lamkính ñeå tieán haønh in situ PCR.7. Duïng cuï : OÁng Eppendorf “thaønh moûng” (thin-wall), ñaàu tip coù phin loïc NHÖÕNG HAÏN CHEÁ CUÛA KYÕ THUAÄT PCR – CAÙCH KHAÉÊC PHUÏC1. Ngoaïi nhieãm cao do khaû naêng nhaân baûn DNA maïnh Phaân chia khu vöïc thí nghieäm, söû duïng ñaàu tip coù phin loïc, gaêng tay thay thöôøng xuyeân, chieáu tia UV khu vöïc thí nghieäm, söû duïng heä thoáng dUTP-ung,2. Sai soùt cuûa DNA polymerase trong quaù trình toång hôïp Laëp laïi phaûn öùng PCR neáu caàn thieát, söû duïng loaïi polymerase coù tính trung thöïc cao nhö Pfu, DeepVent, UlTma polymerase.3. Keát quaû phuï thuoäc raát lôùn vaøo toaøn boä thao taùc Kyõ thuaät vieân caàn ñöôïc ñaøo taïo toát, töï ñoäng hoùa, söû duïng hoùa chaát pha saún (kit) ñaõ ñöôïc chuaån hoùa4. Thieát bò ñaét tieàn MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP PCR1. PCR : söû duïng 1 caëp moài ; saûn phaåm PCR ñöôïc phaùt hieän baèng ñieän di2. Nested / Semi-nested PCR : söû duïng 1 caëp moài “ngoaøi” vaø 1 moài/1 caëpmoài “trong” ñeå taêng tính ñaëc hieäu vaø ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR3. Multiplex PCR : söû duïng nhieàu hôn 1 caëp moài trong 1 phaûn öùng PCR ñeåphaùt hieän ñoàng thôøi nhieàu trình töï DNA cuûa 1 taùc nhaân (A) hay nhieàu taùcnhaân (B) (A) (B) MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP PCR (tieáp)4. AP-PCR (Arbitrary Primed)/RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA) : söû duïng toå hôïp caùc primer “ngaãu nhieân” ñeå xaùc dònh “daáu aán ditruyeàn” cuûa loaøi (1) (2)5. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : nhaân baûn hai ñaàu muùt 5’vaø 3’ cuûa 1 trình töï exon vôùi 1 moài ñaëc hieäu vaø 1 moài “chung” TTTTTTT AAAAA AAAAAAAA TTTTTT6. In situ PCR : thöïc hieän phaûn öùng PCR ngay treân moâ/teá baøo7. PCR ñònh löôïng : ñònh löôïng saûn phaåm PCR theo thôøi gian thöïc döïatreân maãu doø phaùt huøynh quangRT-PCR Goàm 2 böôùc : 1. RT (Phieân maõ ngöôïc) : taïo cDNA 2. PCR : nhaân baûn cDNA Duøng ñeå nhaân baûn RNA REAL-TIME PCRDuøng ñònh löôïng DNA hoaëc RNA (real-time RT-PCR)Ñònh löôï ...