KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR

Đặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype là xét nghiệm mà các bác sĩ lâm sàng cần xác định trước khi bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để có thể quyết định thời gian điều trị. Có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV, tuy nhiên tiêu chuẩn nhất và hữu dụng lâm sàng nhất vẫn là giải trình tự vùng 5’-NC. Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút ra...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCRTÓM TẮTĐặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype là xét nghiệm mà các bác sĩ lâm sàng cầnxác định trước khi bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để có thể quyết địnhthời gian điều trị. Có nhiều ph ương pháp để xác định genotype HCV, tuy nhiêntiêu chuẩn nhất và hữu dụng lâm sàng nhất vẫn là giải trình tự vùng 5’-NC.Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCRkhuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rútra các kinh nghiệm chủ yếu.Vật liệu và phương pháp: Các mẫu huyết thanh sau khi thu thập sẽ được táchchiết RNA cùng với RNA chứng nội tại được cho vào mẫu và tổng hợp thànhcDNA từ dịch ly trích này. Thực hiện phản ứng real-time PCR dùng mồi và cácđoạn dò Taqman đặc hiệu định lượng HCV có trong mẫu ban đầu. Tiến hành giảitrình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại này, so sánh với ngân hàng gene để địnhcác subtype của HCV. Phân tích các kết quả và rút các kinh nghiệm chủ yếu.Kết quả: Từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2008, tác giả đã áp dụng kỹ thuật này đểđịnh kiểu gene HCV cho 2000 trường hợp với kết quả ghi nhận được: 58% thuộcsubtype 1b, 8% thuộc subtype 1a, 5% thuộc subtype 1c, 10% thuộc subtype 2a,0,4% thuộc subtype 2b và 17% thuộc subtype 6a.Kết luận: Từ kết quả trên chúng ta nhận thấy các bệnh nhân nhiễm HCV ở ViệtNam hầu hết đều tập trung vào subtype 1b và 6a. Trong nghiên c ứu này, tác giả đãđưa ra được kỹ thuật tốt nhất để vừa định lượng, vừa định type trên cùng một sảnphẩm khuếch đại có chứa hỗn hợp DNA đích và DNA chứng nội tại, đồng thờichứa cả hệ thống chống ngoại nhiễm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả cuốicùng của xét nghiệm. Một ưu điểm nữa của phương pháp giải trình tự là có thể chokết quả phân biệt được từng loại subtype trong khi các phương pháp khác sẽ cómột tỉ lệ không cho subtype hay thậm chí không phân biệt đ ược subtype.ABSTRACTAPPLY THE DIRECT SEQUENCING OF THE QPCR PRODUCTSTO DO THE HCV GENOTYPING.Nguyen Thanh Bao, Pham Hung Van* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 243 - 248Background: HCV genotyping is one of the testing that the physicians need to indicatebefore dicide the specific treatment on the HCV infected patients. There are manymethods for HCV genotyping, however, the most effective and sensitive is the directsequencing of the PCR product specific the 5’-NC of the virus.Objective: Set up the techniques for genotyping of HCV by direct sequencing theqPCR product specific to 5’-NC of viral genome, and carry out the analysis of theresults and the outcome experiences.Materials and methods: The collected patients sera were added with the RNA-internal control and then were extracted the total RNA which were carried out thecDNA synthesis. The qPCR using specific primers and taqman probes were doneto quantify the RNA-HCV copies in the samples. The qPCR products weresequenced and the collected sequences were aligned to the library of HCVgenotype sequences to get the results of HCV genotyping.Results: From 1/2007 to 5/2008, authors applied these techniques on 2000samples and the analysed results revealed that: 58% were belong to subtype 1b,8% belong to subtype 1a, 5% belong to subtype 1c, 10% belong to subtype 2a,0.4% belong to subtype 2b and 17% belong to subtype 6a.Conclusions: The received results demonstrated that most of the HCV infected patientsin Viet Nam are infected with genotype 1b and 6a. In this study, the authors haveproved that this testing will not only do the quantity but also do the genotyping of theHCV by direct sequencing of the qPCR products which contain the target sequenceDNA. Another advantage of this testing is the internal control products and build-incontamination system did not influence to the sequencing results. Besides that,sequencing always results the subtype while other methods will give a low ratio or evencan not differentiate the subtype of HCV.ĐẶT VẤN ĐỀTrước khi chỉ định điều trị đặc hiệu, xét nghiệm định lượng và định kiểu genevirus viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm là một xét nghiệm tối cần thiết màbác sĩ phải chỉ định cho bệnh nhân(Error! Reference source not found.). Phương pháp lai trênvạch dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)(Error! Reference source not found.) vàphương pháp giải trình tự với hệ thống giải trình tự kín của Trugene(Error! Referencesource not found.) là hai phương pháp được nhiều nhà lâm sàng chấp nhận để xác địnhkiểu gene HCV dùng trong chẩn đoán. Tuy nhiên, do giá thành khá cao nên xétnghiệm xác định kiểu gene HCV chưa được chỉ định rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệlưu hành HCV là khá cao trên thế giới (5 - 8% người bình thường có nhiễmHCV)(Error! Reference sour ...