Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước

Kể từ khi các kỹ thuật chuyển gene và kỹ thuật di truyền ra đời cho đến nay, nó tạo ra luồng tư tưởng nơi các nhà y sinh học là nhanh chóng ứng dụng các kỹ thuật này trong việc chẩn đóan, chữa trị các bệnh di truyền không chỉ ở mức độ nghiên cứu phòng thí nghiệm mà phải nhanh chóng đưa ra ứng dụng lâm sàng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước Kỹ thuật liệu pháp genemới: ứng dụng nucleasengón tay kẽm đượcthiết kế trướcKể từ khi các kỹ thuật chuyểngene và kỹ thuật di truyền ra đờicho đến nay, nó tạo ra luồng tưtưởng nơi các nhà y sinh học lànhanh chóng ứng dụng các kỹthuật này trong việc chẩn đóan,chữa trị các bệnh di truyềnkhông chỉ ở mức độ nghiên cứuphòng thí nghiệm mà phải nhanhchóng đưa ra ứng dụng lâm sàng.Đến nay nhiều kỹ thuật đã đượcáp dụng khá thành công ở cácdòng tế bào nuôi cấy và thậm chíở mô hình dùng chuột thí nghiệmcác bệnh ở người, nhưng chúngcũng cho thấy một trở ngại thựcsự lớn đó là làm sao chuyểnchúng ra ứng dụng lâm sàng.Trên trang 646 tờ Nature 435, (2June 2005), Urnov và cộng sự đãcông bố công trình nghiên cứutheo đó một phương thức mới giúphiệu chỉnh sửa sai một đột biến ditruyền ở tế báo người. Phương thứcmới này ra đời từ sự kết hợp 2 quátrình sinh học cơ bản vốn dĩ rất bảothủ về mặt tiến hóa: cắt xuyên sợiđôi DNA ở điểm đặc hiệu và sửachữa sai sót sợi DNA bằng sự tái tổhợp đồng dạng. Sự thành công củaUrnov và cộng sự, về mặt lý thuyết,cho thấy hòan tòan có thể ứng dụnglâm sàng. Thành công của các tácgiả là nhờ họ kế thừa và phát triểntừ những nghiên cứu trước đó cũngtrên nền tảng phương thức kết hợphai quá trình sinh học nói trên. Đâythực sự một bước tiến đáng kể trêncon đường ứng dụng kỹ thuật ditruyền vào chữa trị bệnh chongười.Trước hết cần nhắc lại là hầu hếtcác chiến thuật chuyển gene thựcchất là liệu pháp thêm gene, nghĩalà một phiên bản gene bình thường(gene lành) của một gene nào đó sẽđược chuyển vào một dòng tế bàonào đó mà nhà nghiên cứu hay bácsỹ điều trị quan tâm, tại đây chúngsẽ tồn tại đồng thời với phiên bảnđột biến chị em của nó. Nhưng mụcđích sau cùng của việc đưa genevào tế báo là chỉnh sửa đột biến, dovậy gene lành phải có khả năng tạora những protein bình thường dướisự điều khiển của các dấu hiệu điềuhòa nội tại.Quá trình sửa chữa hay hiệu chỉnhđặc hiệu theo điểm của một độtbiến nào đó có thể chia làm 3bước:• Đầu tiên, điểm cần hiệu chỉnhphải được dò tìm trong 3 tỷ cặpbase bộ gene người.• Kế đến, base đóng vai trò kẻthay thế phải được đưa vào tế bàomột cách hiệu quả• Cuối cùng, các yếu tố phản ứngphải được đưa vào dạng tế bàotương ứng trong cơ thể (ví dụ tếbào phổi ở bệnh nhân mắc chứngxơ hóa)Để giải quyết vấn đề đầu tiên,Urnov và cộng sự đã lợi dụng cácZFN (zinc-finger nucleases- cácnuclease ngón tay kẽm). Nhữngprotein tổng hợp này được mô tảđầu tiên từ 1996, sau đó chúngđược cải biến phát triển thành cácyếu tố phản ứng nhằm phân cắtDNA tại một điểm đặc hiệu, do vậychúng bao gồm vùng gắn DNA vàvùng phân cắt DNA.Vùng gắn DNA của ZFN bao gồmmột sợi ngón tay kẽm, sợi nàygồm khỏang 30 amino acid đượclàm bền bằng một ion kẽm. Nhưtên gọi thì vùng gắn lên DNA sẽgắn lên một trình tự DNA đặc hiệu3 base. Trình tự amino acid trongngón tay kẽm biến thiên tùy theotrình tự DNA mà nó sẽ gắn. Trongbộ gene người, người ta tìm thấykhỏang 900 protein mang ngón taykẽm và danh sách này còn sẽ đượcbổ sung nữa trong tương lai.Vùng cắt DNA của ZFN bắt nguồntừ enzyme FokI và tự bản thân nóthì không mang tính đặc hiệu. Đểcó thể có chức năng phân cắt DNA,vùng này phải được nhị trùng hóa(dime). Do đó 2 ZFN phải gắn tạivị trí hoặc gần vị trí cần hiệuchỉnh.Bằng cách liên kết gắn 4 ngón taykẽm theo cách thức sóng đôi, haiZFN này nối sau hai ZFN kia, khiđó chúng tạo ra một vị trí nhận diệnđặc hiệu gồm 24 bp. Và với mộttrình tự 24 bp thì có thể xác địnhmột trình tự duy nhất trong tòan bộgenome, cho phép dò tìm điểm cầnhiệu chỉnh. Như vậy bước đầu tiêncủa quy trình 3 bước đã được giảiquyết.Chú thích: Những bệnh nhân mắchội chứng SCID mang một vài độtbiến đặc hiệu ảnh hưởng chức năngtế bào T. Urnov và cộng sự sửphương thức minh họa ở đây đểhiệu chỉnh khiếm khuyết và thuđược một tỷ lệ thành công đánh kểvới những dòng tế bào nuôi cấymang cùng đột biến. a, ZFN (Zinc-finger nucleases) được thiết kế saocho những vùng ngón tay kẽm sẽnhận diện điểm đặc hiệu gần điểmđột biến. b, Vùng phân cắt sẽ tạo ravết cắt xuyên sợi đôi DNA. c, Mộttrình tự dạng hoang dại (không độtbiến) được đưa vào tế bào và vàđược sử dụng như khuôn mẫu choquá trình sửa chữa DNA trong tếbào – tái tổ hợp đồng dạng diễn ra.d, Trình tự đột biến được sửachữa..Sau khi được nhị trùng hóa,enzyme này sẽ tạo ra một vết cắtxuyên sợi đôi DNA tại vị trí gầnhoặc tại chính xác điểm đột biến.Khi đó, các cơ chế sửa sai của tếbào sẽ được kích họat. Trong số cáccơ chế sửa sai này, thì sự tái tổhợp đồng dạng tức là quá trình sửasai bằng cách sử dụng những trìnhtự tương tự có sẵn trong tế bào làmkhuôn. Trình tự tương tự có thể dễdàng tìm thấy trong genome, nhưngnó cũng có thể tìm thấy từ nhữngvật liệu DNA được con người chủđộng đưa vào trước đó. Như vậybước thứ hai đã được giải quyết-thay đổi một base.Điểm đặc trưng đáng chú ý trongquy trình phức tạp trên là tần xuấtdiễn ra các sự kiện mong đợi.Urnov và cộng sự cho thấy là họ đãthành công khi hiệu chỉnh đượckhỏang 15-20% các nhiễm sắc thểđột biến ở một dòng tế bào nuôicấy theo chu kỳ. Hiệu suất này chophép việc đưa hai ZFNs và khuônDNA bình thường vào tế bào có thểđủ để thực hiện sự thay đổi điểmsai sót. Các tác giả còn thậm chícho rằng họ đã thành công khỏang5% khi tiến hành thực nghiệm trêntế bào T thu từ một bệnh nhân,cũng nên nhớ là hiệu quả cải biếndi truyền trên dòng tế bào T thườngcực kỳ thấp. Kết quả và sự giảithích này hòan tòan phù hợp vớitốc độ tái tổ hợp đồng dạng, ở tếbào không có hiện tượng DNA bịcắt xuyên sợi thì tỷ lệ này chỉkhỏang 0,001%.Đến đây thì một vấn đề đặt ra làcông việc của Urnov và cộng sự cóý nghĩa thế nào trong việc chữa trịbệnh ở người. Trình tự DNA màcác tác giả đã sửa chữa là một trongnhững dạng đột biến gây ra hộichính suy giảm miễn dịch kết hợptrầm trọng - SCID (severecombin ...