KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có chọn lọc bằng tạo dòng in vitro mà không cần sự hiện diện của tế bào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo. Nhờ phản ứng PCR,...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) I. MỞ ĐẦU:  Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ th uật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có chọn lọc bằng tạo dòng in vitro mà không cần sự hiện diện của tế b ào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo. Nhờ phản ứng PCR, một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong bộ gien đ ược khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn đó đ ã biết. II. NGUYÊN TẮC CƠ BẢN:  Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN polymerase dùng các đoạn ADN mạch đ ơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với sợi n ày. Các sợi ADN khuôn mạch đơn có thể tạo ra theo cách đơn giản là đun nóng dung d ịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sôi.  ADN polymerase cũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn ADN mạch đơn (đoạn mồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp. Do đó, để khởi đầu quá trình tổng hợp cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotid), đoạn này gắn bổ sung vào ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.  Cả hai sợi ADN đều được dùng đ ể làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới đ ược bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia (Hình 1c). Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. 5 3 a) Vật liệu khởi đầu là phân tử ADN m ạch kép 3 5 Các đoạn mồi b) Các sợi tách nhau ra khi gia nhiệt 94oC, sau đó h ạ xuống 30-65oC, 5 3 trong 30 giây để các đoạn mồi gắn vào hai vị trí tương hợp trên ADN 3 5 c) Taq polymerase tổng hợp các sợi 5 3 ADN mới tương hợp với sợi khuôn, bắt đầu từ đoạn mồi kéo dài về phía đoạn mồi nằm b ên sợi kia. 3 5 d) Hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt. Sợi ban đầu và sợi mới tổng hợp tách nhau ra. Trên hai 3 5 sợi mới tổng hợp xuất hiện 2 điểm bám cho các đoạn mồi gắn vào. 5 3 e) Taq polymerase tổng hợp các sợi ADN tương hợp mới, nhưng các chuỗi mới lần này ch ỉ tiến đến đúng vị trí đã được xác định bởi các cặp đoạn mồi đã lựa chọn. f) Quá trình được lặp lại, các đoạn mồi tiếp tục gắn vào các sợi mới tổng hợp. 5 3 g) Taq polymerase tổng hợp các đoạn tương hợp sinh ra hai đoạn ADN mạch kép giống hệt đoạn 5 3 cần tổng hợp. Quá trình cứ thế tiếp tục. 3 ác C đoạn mong muốn 5 5 3 H ình 1. Sơ đồ nguyên lý phản ứng chuỗi 3 5 … và cứ thế tiếp tục trùng hợp PCR. ...