Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao

KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH PHẨM Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán laoKỹ thuật PCR trong chẩn đoán laoKỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH PHẨMKỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biếtvà sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Đối vớiM.tuberculosis, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 đôi bazơ nằm trên đoạn IS 6110, là trình tự gắn (IS-insert sequence) đặc hiệu và có khả năng tự sao chép với số lượng lớn (1-25 lần) trong genome vi khuẩnthuộc nhóm M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum).Quá trình sao chép được thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với sự tham gia của enzyme chịunhiệu Taq polymerase có bản chất là ADN polymeraza, các deoxynucleotide triphosphat tự do (dATP,dTTP, dGTP, dCTP) và cặp đoạn mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự định sao chép.Sản phẩm PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gen agarosa hoặc các kỹ thuật lai ghép miễndịch khác như lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern blot hoặc lai ghép với cơ chấttrên phiến nhựa, v.v.I. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẦN BIẾT VỀ PCRI.1. Nguyên lý của PCRPCR là kỹ thuật khuyếch đại số lượng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy trình tiến hànhgồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp kéo dài với sự trợ giúp của ADN polymerase chịunhiệt, primers và deoxy-nucleotide triphosphates (dNTPs)I.2. Thông số chu kỳ PCRPCR được thực hiện với các chu trình ủ bệnh phẩm đã xử lý ở 3 nhiệt độ khác nhau tương ứng với 3giai đoạn cần thiết cho việc tổng hợp ADN. Mỗi chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn: Biến tính ở 90-950C, gắnmồi ở 40-650C và tổng hợp kéo dài ở 70-750C. Tuỳ theo nồng độ ADN đích có trong bệnh phẩm mà xácđịnh số lượng chu kỳ cần thực hiện, số lượng trình tự khuyếch đại càng nhiều nếu số chu kỳ càng tăng. I.3. Các bước cần thiết để tránh nhiễm với M.tuberculosis hoặc sản phẩm PCR (amplicon) từđợt trước I.3.1. Yêu cầu đối với phòng thí nghiệm:Quy trình thực hiện PCR cần được tiến hành tại 3 phòng thí nghiệm khác nhau và theo nguyên tắc lưuthông một chiều để giảm thiểu lây nhiễm gây dương tính giả. Phòng thứ nhất: chuẩn bị hỗn dịch nền(Mix) chạy PCR; phòng thứ hai: chuẩn bị và xử lý mẫu bệnh phẩm và cho bệnh phẩm vào ống chứamix; phòng thứ ba: phân tích sản phẩm PCR. Vận chuyển dụng cụ và hoá chất cần theo chiều từ phòngthứ nhất (chuẩn bị mix) đến phòng thứ ba, không được theo hướng ngược lại.Các dung dịch hoá chất pha chế và xử lý cần được khử trùng bằng hấp ướt ở 1210C trong 20 phút.Nguyên vật liệu như ống chạy PCR, đầu côn, pipet Pasteur, ống đựng bệnh phẩm, găng tay, v.v. cầnđược vô trùng và chỉ được dùng 1 lần, không dùng lại. I.3.2. Sử dụng enzyme tiêu diệt lây nhiễm sản phẩm PCR (amplicon) của những đợt trước:Enzyme uracil ADN glycosylasa (UDG) có tác dụng nhận biết và cắt trình tự ADN-sản phẩm PCR ở vịtrí Uracil (U) và tạo những mảnh ADN gãy vụn, vô hiệu hoá amplicon nhiễm từ những đợt PCR trướcđó. Do vậy, trước khi thực hiện các chu kỳ khuyếch đại trong chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm ở 400Ctrong 10 phút với enzyme UDG để phá các trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ các đợt trước. Các chu trìnhkhuyếch đại tiếp theo sẽ làm bất hoạt hoạt tính của UDG với nhiệt độ > 550C. Sau khi chạy xong cácchu kỳ khuyếch đại, ủ mẫu ở 720C trong thời gian hơn 30 phút để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính củaUDG, không gây cản trở cho việc đọc kết quả PCR.II. KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH M.TUBERCULOSIS II.1. Pha hỗn dịch Mix (thực hiện tại phòng chuẩn bị Mix)Để pha chế hỗn dịch mix, tính số lượng mẫu cần xét nghiệm và tính toán lượng Mix cần thiết với cácthành phần tương ứng. Dưới đây là ví dụ cách tính để pha đủ cho 50 ống PCR với lượng 50ul mix/ống. Số lượng (ul) cho Nồng độ cuối TrìnhThành phần tự cho vào tổng 50ul/ống cùngNước cất 2 lần Milli Q Tính lượng cần thiết (a) 10mM TrisHClĐệm phản ứng (10x) (b) 5 50 mM NaClTris 100mM, pH 8,3 (c) 5 0,01% 4 hoặc 6NaCl 500 mM (d) 2-3 mM 0,2 mM/loạiGelatin 0,1% (w/v) (e) 0,5MgCl2 25mM (g) 0,2 0,2 uMdNTP (hỗn hợp) (h) 0,2 1U/50ul 0,2/ống - dATP 20mM (i) 0,2 5-15ul/ống - dCTP 20mM (k) 5-15 - dGTP 20mM - dUTP 20mMMồi: 50uM 330ug/mlAmpli Taq polymerasaUracil-ADN-glycosylase(UDG) 1U/ul ...