KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

Mục tiêu: Xác định thành phần loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) gây bệnh trên người tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng sinh học phân tử.Phương pháp: Kỹ thuật Nested PCR được áp dụng trong nghiên cứu này. Các cặp mồi được sử dụng là các cặp mồi đặc hiệu đối với từng loài Plasmodium. Kết quả và kết luận: phân tích 58 mẫu có KSTSR (+) tại xã Bù Gia Mập cho ta thấy có 4 loài KSTSR gây bệnh ở người, trong đó P. falciparum chiếm 60,9%; P. vivax chiếm...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định thành phần loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) gâybệnh trên người tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằngsinh học phân tử. Phương pháp: Kỹ thuật Nested PCR được áp dụng trong nghiên cứu này.Các cặp mồi được sử dụng là các cặp mồi đặc hiệu đối với từng loài Plasmodium. Kết quả và kết luận: phân tích 58 mẫu có KSTSR (+) tại xã Bù Gia Mập chota thấy có 4 loài KSTSR gây bệnh ở người, trong đó P. falciparum chiếm 60,9%; P.vivax chiếm 34,8%; P. malariae chiếm 2,9%; P. ovale chiếm 1,4%. Tỷ lệ nhiễm đơnP. falciparum chiếm 55,2%; nhiễm đơn P. vivax chiếm 24,1%; nhiễm đơn P. malariaechiếm 3,4%; nhiễm phối hợp 2 loài là 15,5%; nhiễm phối hợp 3 loài là 1,8%. ABSTRACT Objectives: In this study, we use the Polymerase Chain Reaction (PCR) tofind out four human malaria parasite species. Methods: PCR is a highly sensitive method through which the presence ofa particular DNA sequence in a given sample can be established. Theoligonucleotide primer and original amplification conditions for Plasmodiumspecies detection were developed and published by Snounou et al., 1995. Results and conclusions:Among 494 patient blood samples collected in BuGia Map commune–Bu Đang district - Binh Phuoc province from August toDecember, 2005, there were 58 malarial cases with 32 cases of single P.falciparum infection (55.2%), 14 cases of single P. vivax infection (24.1%), 2cases of single P. malariae infection (3.4%) and 10 cases of mixed infection (P.falciparum + P. vivax + P. ovale) (17.3%). The Giemsa stain revealed mixedinfection rate of only 8.7%. Ngày nay, một vấn đề mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là P.faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã làm biến dạng hình thái các chủngloại KST SR (Xét nghiệm kính hiển vi và sự nhầm chủng loại, Viện Sốt Rét KST -CT Trung Ương, 1965). Do đó, việc xác định đúng loài KSTSR đóng vai trò quantrọng trong điều trị. Hiện nay, đối với sốt rét, ngoài phương pháp nhuộm giêm saphát hiện KST SR còn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như:nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck, Para-sight F ...và đặc biệt là kỹ thuậtPCR. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật có độ nhạycao, có khả năng phát hiện đ ược những trường hợp có nhiễm KST mật độ thấp(5-10 KST/ml máu), phát hi ện được 4 loài KSTSR gây bệnh trên người hoặcnhiễm phối hợp 2 hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượngmà kính hiển vi không thể phát hiện hay phân biệt được đầy đủ và chính xác(1,6).Trong chương trình sàng lọc KST SR để điều trị tiệt căn, sự ứng dụng kỹ thuậtPCR để xác định thành phần cơ cấu KST SR tại những vùng sốt rét lưu hànhnặng là khả thi trong tình hình sốt rét hiện nay(5,7,8). Mục tiêu - Xác định thành phần loài và tỷ lệ nhiễm phối hợp KSTSR tại xã Bù GiaMập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật PCR. - So sánh với phương pháp nhuộm Giemsa. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Địa điểm nghiên cứu Xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng sốtrét lưu hành nặng. Trong 6 tháng đầu năm 2004 có tỷ lệ lam d ương tính/lam soi là:25,04%, tỷ lệ mắc /1.000 dân là: 32,89. Vì vậy chúng tôi chọn địa điểm này để tiếnhành nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu Tất cả những bệnh nhân đang sốt hay có sốt trong vòng 3 ngày trước đó. Thu thập mẫu Thời gian thu thập mẫu: Từ tháng 6/2005 đến tháng 12/2005. Phương pháp thu thập mẫu: Điều tra cắt ngang được tiến hành 3 đợt trên 9 thôn của xã Bù Gia Mập: BùNga, Thôn 8, Bù La, Bù Dốt, Đắk á, Bù Lên, Bù Lư, Bù Rên, Đắk Côn. Đợt 1 vàotháng 8/2005 được 416 lam, đợt 2 vào tháng 10/2005 được 720 lam và đợt 3 tháng12/2005 được 141 lam. Tổng cộng 1.277 lam. Tất cả các lam đều được nhuộmgiemsa. Trong đó 494 người (theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giớitính, tuổi, nghề nghiệp ....) được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấmWhatman 3MM để khô ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệtcó đánh số thứ tự. Các mẫu này được tách chiết và phân tích bằng phương phápPCR xác định thành phần KSTSR tại khoa SHPT của Viện. Phương pháp tách tinh khiết DNA Ap dụng phương pháp của Kain K.C, Lannar và cộng sự (1995) tách tinhkhiết DNA bằng Chelex100.Phản ứng PCR(Khoa SHPT - Viện Sốt Rét KST-CT Trung Ương).Vật liệuHóa chất dùng để tách chiết DNA của hãng SigmaHoá chất dung cho phản ứng PCR:+ dATP, dTTP, dCTP, dGTP (Abgene)+ Tag polymerase (Abgene)+ Primer (mồi): PLU5, PLU6 (Poligo), FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma)Lam kính, thuốc nhuộm giêmsaGiấy thấm Whatman 3MMNested 1: Phản ứng PCR để nhân ...