Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 3

Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 3 23 Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả.3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA được khuếch đại theo phương pháp PCR với cặp primer có trình tự cụ thể như sau: - METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’ - METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Bảng 3.1 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Metarrhizium Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) 2.5µl - PCR buffer 1X 1.5mM 0.75µl- MgCl2- dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl 50ng 1.5µl- METPR1- METPR4 50ng 1.5µl- Tag DNA polymerase 0.04UI 0.5µl- DNA khuôn 125ng 1µl- Nước cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l 24 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt khuếch đại gen Pr1 trên nấm Metarrhizium Các bước Nhiệt độ Thời gian 940C - Tách đoạn DNA 5 phút - Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) 940C - Tách đoạn DNA 1 phút 570C - Ủ bắt cặp 1 phút 720C - Kéo dài 2 phút 720C - Kéo dài 6 phút 40C -Ủ 6 phút 3.4.5.2 Nấm Baeuveria Bassiana vuille Đọan DNA được khuếch đại có trình tự primer cụ thể như sau : Primer Trình tự (5’-3’) ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGBảng 3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Beauveria Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) - PCR buffer 1X 2.5µl 1.5mM 0.75µl - MgCl2 200mM mỗi dNTP 0.5µl - dNTP - ITS 4 50ng 1µl - ITS 5 50ng 1µl 1UI 0.25µl - Tag DNA polymerase - DNA khuôn 100ng 1µl - Nước cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l 25Bảng 3.4 Quy trình nhiệt khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 trên nấm Beauveria Các bước Nhiệt độ Thời gian 940C - Tách đoạn DNA 3 phút - Số chu kỳ lặp lại (30 chu kỳ) 940C - Tách đoạn DNA 1 phút 560C - Ủ bắt cặp 30giây 720C - Kéo dài 4 phút 720C - Kéo dài 7 phút 40C -Ủ 10 phút 3.4.6 Điện di và đọc kết quả trên gel Agarose 3.4.6.1 Điện di trên gel Agarose - Cho 0.125 gram agarose vào 12.5ml dung dịch 0.5X TAE. - Đun sôi hỗn hợp trê ...