Luận văn: XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 8

2.5. Lugol Indine Potassium iodone Nước cất 2.6. Fuchin kiềm Fuchin kiềm Phenol Nước cất Lắc đều lọc qua giấy 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth) Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột với chất chỉ thị màu iodine. Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 30oC, khi có ion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với iodine. Hoạt tính của...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn: XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 82.5. Lugol Indine 1g Potassium iodone 2g Nước cất 300 ml2.6. Fuchin kiềm Fuchin kiềm 10 ml (dung dịch bão hòa trong rượu etylic 95%) Phenol 5 ml Nước cất 100 ml Lắc đều lọc qua giấy3. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth) Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượngtinh bột với chất chỉ thị màu iodine. Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 30oC, khi cóion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với iodine. Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên 1 ml dịchmôi trường hoặc 1 ml dung dịch chiết enzyme. 3.1.1. Thiết bị, vật liệu và hóa chất Bình tam giác hay bình cầu Ống nghiệm Máy ly tâm hay máy lọc Pipet tự động Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận môi trường thạch có chứa vi sinh vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1 - 2 giờ trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Lọc hoặc ly tâm để thu được dịch chiết trong suốt. Nếu môi trường nuôi cấy là dịch thể chỉ cần ly tâm tách sinh khối rồi sử dụng phần chất lỏng trong suốt thu được để phân tích. Dung dịch tinh bột 0,1% Dung dịch NaCl 0,1% Dung dịch iod 0,02% 3.1.2. Cách tiến hành Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1ml dung dịch NaCl 0,1%. Thêm vàoống thứ nhất 1ml enzyme rồi lắc đều, lấy 1 ml chuyển sang ống thứ hai lại lắc đều vàlấy 1ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ thế cho đến ống thứ 10, sau cùng lấy 1ml ở ốngthứ 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều, giữ ở 30oC trong30 phút. Làm lạnh, cho vào một giọt dung dịch iodine 0,02 N. Ghi nhận ống có độ phaloãng lớn nhất mà không tạo màu với iodine. Ví dụ: Các ống từ 1 đến 4 không tạo màu, nhưng ống thứ 5 trở đi có màu thì hoạt tínhcủa enzyme trong 1ml dung dịch enzyme là 16 2 = 32 đơn vị. Trong đó 16 là độ phaloãng của dung dịch enzyme trong ống thứ 4, 2 là số mg tinh bột trong mỗi ống nghiệm.3.2. Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (phương pháp Gross và Fluld) Trong môi trường kiềm yếu, casein bị hòa tan nhưng khi thêm acid acetic trongethanol, casein bị kết tủa. Trái lại, các sản phẩm thủy phân của casein lại không bị kếttủa trong điều kiện này. Phương pháp Gross và Fluld dựa trên cơ sở xác định lượngenzyme ít nhất cần thiết để phân giải 2 mg casein đến mức không bị kết tủa bởi acidacetic trong ethanol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme 1 ml dung dịch nghiên cứu có khả năngphân giải 1 mg casein ở 38oC trong thời gian 30 phút. 3.2.1. Thiết bị, vật liệu và hóa chất Bể điều nhiệt hay tủ ấm (38oC) Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Ống nghiệm Dung dịch casein 0,1% Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol 3.2.2. Cách tiến hành Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô Cho vào mỗi ống 1 ml nuớc cất, trừ ống thứ nhất Cho vào ống thứ nhất và ống thứ hai mỗi ống 1 ml dịch chứa enzyme, lắc đều.Chuyển 1ml dung dịch của ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc đều. Chuyển 1ml dung dịchcủa ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc đều. Cứ như vậy cho đến ống thứ 12. Lấy 1 ml từống thứ 12 bỏ đi. Như thế thể tích chất lỏng trong tất cả các ống đều là 1 ml. Tăng nhiệt độ của các ống đến nhiệt độ 38oC bằng cách đặt chúng vào bể điềunhiệt cài ở 380C từ 10 – 15 phút. Thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 38oC, lắc đều. Giữ ở38oC trong 30 phút. Đúng 30 phút làm lạnh ngay trong nuớc đá để ngừng phản ứng. Nhỏ theo váchmỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic trong dung dịch ethanol. Nếu thấy tất cả các ống đều kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không đủ đểphân giải hết casein. Cần phải chuẩn bị lại dung dịch enzyme có nồng độ cao hơn. Cònnếu ở tất cả các ống đều không xuất hiện kết tủa cần phải pha loãng dung dịch enzymeđem phân tích. Trong trường hợp có một số ống xuất hiện kết tủa, số còn lại không kết tủa thìchọn lấy ống không kết tủa cuối cùng (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) là ống cólượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2 mg casein. Ví dụ, ở ống thứ7 là ống cuối cùng không cho kết tủa, lượng enzyme ban đầu bị pha loãng 64 lần trongống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme ban đầu, và như vậy 1 mldung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ là 2/0,0156 = 128 đơn vị. Từ đó tính ra hoạt độcủa enzyme trong 1 gam chế phẩm.3.3. Cách Nhuộm Gram Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn. ...