Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh da

Miễn dịch huỳnh quang ( Immunofluorescence: IF) là một kỹ thuật hoá mô cần thiết để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên đó. Kháng thể đặc hiệu được gắn với phức hợp huỳnh quang (Fluorescein Isothiocyanate: FITC ), giúp chúng ta dễ dàng quan sát thấy được các phản ứng miễn dịch, đồng thời không làm thay đổi các phản ứng miễn dịch. Phức hợp khỏng thể huỳnh quang được thờm vào mụ tổ chức và sẽ gắn chặt vào kháng nguyên, sẽ tạo nên một phức hợp miễn dịch bền vững....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh da Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán bệnh daĐại cương:Miễn dịch huỳnh quang ( Immunofluorescence: IF) là một kỹ thuật hoá mô cầnthiết để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên đó. Khángthể đặc hiệu được gắn với phức hợp huỳnh quang (Fluorescein Isothiocyanate:FITC ), giúp chúng ta dễ dàng quan sát thấy được các phản ứng miễn dịch, đồngthời không làm thay đổi các phản ứng miễn dịch. Phức hợp khỏng thể huỳnhquang được thờm vào mụ tổ chức và sẽ gắn chặt vào kháng nguyên, sẽ tạo nênmột phức hợp miễn dịch bền vững. Không một kháng thể nào bị mất trong quátrình rửa, và kết quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Bộ điều ho àcủa kính hiển vi chứa nguồn ánh sáng có cường độ lớn, kích thích kính lọc để tạora bước sóng có khả năng gây hoạt hoá huỳnh quang, tấm chắn của kính lọc có tácdụng loại bỏ các bước sóng gây nhiễu của ánh sáng. Khi quan sát bằng kính hiểnvi huỳnh quang phải quan sát dưới với nền tối, kháng nguyên gắn đặc hiệu vớikháng thể huỳnh quang có thể được phát hiện bởi màu xanh lục sáng.Có 3 loại kỹ thuật MDHQ cơ bản dùng trong chuyên ngành da liễu:- MDHQ trực tiếp ( Direct Immunofluorescein : DIF )- MDHQ gián tiếp ( Indirect Immunofluorescein : IIF )- MDHQ gián tiếp bổ thể ( Complement Indirect immunofluorescein : CIIF )MDHQ trực tiếp là kỹ thuật xét nghiệm để xác định kháng thể ở da của ngườibệnh.MDHQ gián tiếp là kỹ thuật xác định kháng thể ở trong huyết thanh, huyết tương,dịch bọng nước hoặc các dịch khác.MDHQ gián tiếp bổ thể là sự biến đổi của kỹ thuật MDHQ gián tiếp để xác địnhkháng thể có gắn bổ thể ở trong dịch của người bệnh.Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp( Viết tắt: DIF )DIF là phương pháp nhuộm hóa mô để xác định kháng thể hoặc các proteinkhác của tổ chức mô.Trong da liễu, DIF để xác định sự lắng đọng của các Globulin miễn dịch ( IgG,IgM, IgA ), Bổ thể ( C3 ) và Fibrinogen ở tổn thương da của người bệnh. Mảnh cắtlạnh được ủ với các FITC gắn kháng thể. Để thu được huỳnh quang đặc hiệu tốtnhất cần pha thật chính xác các phức hợp huỳnh quang và nên nhuộm tiêu bảnchứng .Đối với DIF, mảnh sinh thiết nên được cắt lạnh, chia làm 5 lam và mỗi lam có ítnhất 2 lát cắt có độ dày 4 àm, sau đó để khô bằng quạt gió trong 10 phút, rửa bằngPBS có pH 7,4 trong 10 phút, Lần rửa đầu tiên này có tác dụng loại bỏ OCT xungquanh mảnh cắt và cũng loại bỏ các Protein không đặc hiệu khác có trong mảnhcắt, mảnh cắt lại tiếp tục đ ược làm khô bằng quạt gió, mỗi lam được phủ với 1 loạiGlobulin miễn dịch gắn với FITC và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Nhữngkháng huyết thanh không phản ứng sẽ được rửa bỏ bằng PBS trong 10 phút (5phút /lần). để khô bằng gió quạt lần nữa, gắn lam men bằng 1 giọt Bufferglycerol, đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang.Kháng thể kháng Ig lát cắt sinh thiếtcó gắn các markerhuỳnh quangHình 1: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếpChọn vị trí tổn thương :Để đạt kết quả phản ứng MDHQ trực tiếp, thì chọn vị trí tổn thương thích hợp đểchích thủ là cực kỳ quan trọng vỡ chất phản ứng miễn dịch có thể ở vùng này màkhông ở vùng khác như trong bệnh LE và DH, đôi khi phải tiến hành cắt lại mảnhsinh thiết khác để có được chẩn đoán đúng.Mảnh sinh thiết có đường kính 4 – 5 mm, vị trí sinh thiết nên lấy tại:1. Đối với tổn thương là bọng nước : mảnh sinh thiết nên lấy ở bờ, 1/2 là dalành, 1/2 là tổn thương bọng nước, vì cấu trúc của thượng bì bị biến đổi ở vùng cótổn thương bọng nước nên xác định vị tri khu trú của các kháng nguyên bất thườngkhó khăn.2. Các loại tổn thương khác : mảnh sinh thiết đúng vào vị trí của tổn thương3. Những tổn thương nghi ngờ là tổn thương của viêm mao mạch nên cắt các tổnthương sớm < 12 giờVị trí cắt sinh thiết Bọng nước Xq bọng nước Da lànhCách bảo quản và vận chuyển bệnh phẩmMảnh sinh thiết dùng để làm phản ứng MDHQ không nên cố định bằng bất kỳ mộtloại hoá chất nào. Để tránh cho mảnh sinh thiết bị khô, nên gói bệnh phẩm tronggạc tẩm ướt bằng nước muối 9 ‰. và để ngay bệnh phẩm vào ni tơ lỏng càng sớmcàng tốt.Trong trường hợp không có Ni tơ lỏng, thì nên giữ bệnh phẩm trong môi tr ườngvận chuyển Michel ở nhiệt độ 4°c và chuyển đến phòng xét nghiệm trước 24 giờCách làm đông lạnh nhanh:Có nhiều phương pháp làm đông lạnh bệnh phẩm nhanh. nếu đông lạnh trong Nitơ lỏng, thì nên để bệnh phẩm trong một ống khô, sạch hoặc trong ống nhựa, ốngtráng nhôm hoặc để trong nang gelatin trước khi cho vào Ni tơ lỏng. Tuyết của đákhô hoặc Aceton hoặc cồn Ethanol cũng có thể là chất làm lạnh để bảo quản bệnhphẩm, nhưng bệnh phẩm nên để trong ống để tránh tiếp xúc với chất làm tan mô.Một phương pháp làm đông lạnh tạm thời khác là dùng cốc 15mm có tráng nhôm.Hoặc vùi bệnh phẩm vào chất vùi gọi là OCT rồi làm đông nhanh và giữ bệnhphẩm ở - 70°C cho tới khi đ ...