Một số vấn đề về di truyền học (kỹ thuật phân tích protein)

Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh sạch protein Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận “mù mờ”.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Một số vấn đề về di truyền học (kỹ thuật phân tích protein) TRƯỜNG…………………………… KHOA……………………………..Một số vấn đề về di truyền học (kỹ thuật phân tích protein)Một số vấn đề về di truyền học (kỹ thuật phân tích protein)V.1 Các kỹ thuật phân tích proteinV.1.1. Chuẩn bị dịch chiết tế bào đểtinh sạch proteinViệc phân lập và tinh sạch được cácloại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyếtđịnh đến khả năng tìm hiểu được chứcnăng của chúng. Mặc dù trong một sốtrường hợp, chúng ta có thể nghiêncứu chức năng của protein ở dạng hỗnhợp phức tạp, nhưng phần lớn nhữngnghiên cứu này thường dẫn đếnnhững kết luận “mù mờ”. Chẳng hạnnhư khi chúng ta nghiên cứu về hoạttính của một enzym ADN polymerasetrong một hỗn hợp protein thô (chẳnghạn từ dịch phân giải tế bào), cácenzym ADN polymerase và proteinthành phần khác cũng có thể ảnhhưởng đến hiệu suất tổng hợp ADNquan sát được trong thực nghiệm. Vìvậy, việc tinh sạch các protein là mộtbước quan trong trong quá trình tìmhiểu về chức năng của chúng.Mỗi một protein thường có một sốđặc tính riêng làm việc tinh sạchchúng thường có tính đặc thù. Điềunày thì trái ngược với ADN, vốn cơbản giống nhau về cấu trúc và thànhphần, chỉ khác nhau về trình tự củacác nucleotit. Các bước tinh sạch từngloại protein thường dựa trên các đặctính đặc thù của nó về kích thước,hình dạng, điện tích và nhiều khi làchức năng của chúng.Vật liệu khởi đầu cho hầu hết các quátrình tinh sạch protein từ sinh vật làcác dịch chiết tế bào. Không giốngADN vốn có tính phục hồi cao trongcác điều kiện nhiệt độ sống khácnhau, thì protein rất dễ bị biến tính vàphá hủy sau khi bị giải phóng ra khỏitế bào. Vì lý do này, hầu hết quá trìnhchuẩn bị các dịch chiết và tinh sạchprotein được tiến hành ở nhiệt độ lạnh(4oC). Có một số cách chuẩn bị dịchchiết tế bào. Các tế bào có thể phângiải bằng sử dụng chất tẩy, các lựclàm vỡ thành tế bào, xử lý với dungdịch nhược trương (làm tế bào trươnglên do nước đi vào và vỡ ra), hoặcthay đổi đột ngột áp suất. Điểm chungcủa tất cả các phương pháp là làmthành tế bào vỡ ra và các protein đượcgiải phóng. Trong một số trường hợp,các tế bào được chuyển về trạng tháiđông lạnh trước khi được nghiền bằngnhững máy nghiền mẫu trong phòngthí nghiệm.V.1.2. Sử dụng sắc ký cột trong tinhchế proteinPhương pháp chiết xuất và tinh sạchprotein phổ biến nhất là sắc ký cột.Trong trường hợp này, các phân đoạnprotein được cho chạy qua cột nhồibằng các hạt agarose hoặcpolyacrylamit nhỏ được cải biến chophù hợp. Có một số phương án khácnhau trong việc sử dụng cột tách chiếtvà tinh sạch protein. Các quy trìnhkhác nhau được thiết lập có thể khácnhau do đặc tính khác nhau của cácloại protein. Ở đây mô tả ba phươngpháp. Trong hai phương pháp đầu,protein được phân lập dựa vào kíchthước và tính tích điện của chúng.Tóm tắt về các phương pháp này đượcnêu trên hình 14.Sắc ký trao đổi ion: Trong phươngpháp này, các phân tử protein đượcphân lập dựa trên điện tích ion hóa bềmặt của chúng bằng việc sử dụng cácvật liệu làm cột là các hạt mang cácnhóm chức tích điện âm hoặc dương(đây còn được gọi là pha tĩnh). Cácphân tử protein tương tác yếu với cáchạt (chẳng hạn như một phân tửprotein tích điện dương được chochạy qua cột mang các hạt tích điệnâm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng mộtdung dịch muỗi loãng chảy qua cộtsau đó (dung dịch chạy mẫu được gọilà pha động). Các phân tử tương tácvới pha động càng mạnh, càng cầndung dịch hàm lượng muối cao để hồilưu mẫu (bởi muối làm trung hòacác vùng mang điện tích và vì vậy chophép các phân tử protein được giảiphóng khỏi cột. Bằng việc tăng dầnnồng độ muối trong các dung dịchđệm thu hồi mẫu, các phân tử proteinkhác nhau, kể cả các phân tử có đặctính tích điện gần giống nhau cũngđược phân tách thành các phân đoạnkhác nhau khi chúng được hồi lưu từcột.Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật này cho phépphân tách các loại protein trên cở sởđặc điểm khác nhau của các loạiprotein về hình dạng và kích thước.Khác với trong kỹ thuật sắc ký traođổi ion, các hạt được sử dụng để nhồicột trong kỹ thuật này không mangcác nhóm tích điện mà thay vào đó làmang các lỗ có kích thước khác nhau.Các phân tử protein càng nhỏ càng cónhiều khả năng thâm nhập vào tất cảcác lỗ; vì vậy, thời gian chạy qua cộtdài hơn và thời gian hồi lưu muộnhơn. Ngược lại, các phân tử proteinkích thước càng lớn càng có thời gianhồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớmhơn.Đối với mỗi loại cột, các phân đoạnsắc ký được thu ở các nồng độ muốikhác nhau hoặc ở các thời gian hồilưu khác nhau để thu được từng loạiprotein được quan tâm nghiên cứu.Các phân đoạn có hoạt tính proteinđược quan tâm cao nhất sẽ được tíchlũy và tiến hành tinh sạch bổ sung.Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽtăng lên khi các phân đoạn proteinđược chạy qua nhiều cột sắc ký khácnhau. Thông thường một cột sắc kýđơn lẻ không đủ để tinh sạch đượcmột loại phân tử protein mong muốnnào đó dù quá trình sắc ...