Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng)

Tổng hợp hóa học và sử dụng các đoạn oligonucleotit Các đoạn ADN có trình tự xác định kích thước ngắn được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu khác nhau của di truyền học phân tử, chẳng hạn như sử dụng làm mồi trong các phản ứng PCR, hay dùng làm mẫu dò trong các phương pháp lai phân tử.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng)Một số vấn đề về di truyền học(tổng hợp & sử dụng)Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng)V.1.5. Tổng hợp hóa học và sử dụngcác đoạn oligonucleotitCác đoạn ADN có trình tự xác địnhkích thước ngắn được sử dụng nhiềutrong các nghiên cứu khác nhau của ditruyền học phân tử, chẳng hạn như sửdụng làm mồi trong các phản ứngPCR, hay dùng làm mẫu dò trong cácphương pháp lai phân tử. Các đoạntrình tự này thường được tổng hợptheo phương pháp hóa học và đượcgọi là các đoạn oligonucleotit.Phương pháp hóa học được sử dụngphổ biến nhất được tiến hành trên bềmặt cứng sử dụng máy tự động. Tiềnchất để tạo nên các nucleotit lần lượtgắn với đoạn oligonucleotit theo trậttự nhất định được gọi là các hợp chấtphosphoamidine (xem hình minh họa). Phản ứng kéo dài chuỗioligonucleotit diễn ra bằng việc gắnthêm tiền chất nucleotit mới vào phíađầu 5’, như vậy ngược chiều với phảnứng kéo dài chuỗi ADN sử dụngenzym ADN polymerase.Phương pháp tổng hợp hóa học cóhiệu quả và độ chính xác cao khi tiếnhành tổng hợp các phân tử ADN mạchđơn có độ dài tới 30 nucleotit. Với cácthiết bị tổng hợp oligonucleotit hiệnnay, một người nghiên cứu có thể dễdàng tổng hợp bất cứ một trình tựADN ngắn nào đơn giản bằng cách gõvà nhập trình tự nucleotit mong muốnvào phần mềm máy tính điều khiểnmáy tổng hợp tự động. Tuy vậy, khiphân tử ADN được tổng hợp có kíchthước lớn thì độ chính xác của trình tựvà độ đồng đều của sản phẩm tạothành giảm đi do các lỗi cố hữu mangtính kỹ thuật. Thực tế, các phân tửADN có trình tự dài hơn 100 nucleotitkhó có thể được tổng hợp bằng cácphương pháp hóa học mà đảm bảođược số lượng và chất lượng mongmuốn.Các đoạn oligonucleotit kích thướcngắn ngoài các ứng dụng làm mồiphản ứng PCR hay làm mẫu dò nhưđược nêu ở trên, còn có thể được sửdụng cho nhiều mục đích khác trongnghiên cứu di truyền học phân tử.Chẳng hạn như các đoạnoligonucleotit kết cặp sai với mộtđoạn ADN được tách dòng có thểđược dùng để tạo ra một đột biến địnhvị trí. Phương pháp này, gọi làphương pháp gây đột biến định vị trí,được thực hiện như sau: một trình tựnucleotit nhất định được tiến hành laivới một phân đoạn ADN, ở đây đoạnoligonucleotit được sử dụng làm mồicòn phân đoạn ADN đích được dùnglàm khuôn. Trong đoạn ADN sợi képhình thành sẽ có một vị trí kết cặp sai,và theo nguyên tắc PCR, các phânđoạn ADN được tạo ra trong các phảnứng về sau đều mang đột biến tại vị tríkết cặp sai.Các đoạn oligonucleotit cũng có thểđược sử dụng theo cách tương tự nhưvậy để tạo nên một điểm cắt giới hạnmới trong một phân tử ADN, để rồisau đó điểm cắt giới hạn này được sửdụng để cài đoạn ADN đích vào giữamột trình tự mã hóa và một trình tựkhông mã hóa, hoặc sau một trình tựpromoter hay vị trí gắn của ribosom,v.v..Như vậy, rõ ràng trong các nghiêncứu di truyền học phân tử, việc cácđoạn oligonucleotit có thể được tổnghợp theo một trình tự bất kỳ có nhiềuý nghĩa ứng dụng quan trọng trongviệc xác định và khuếch đại các đoạnADN đặc hiệu, để giải mã trình tựADN, cũng như trong các nghiên cứutạo đột biến điểm xác định vị trí, haysử dụng cho công nghệ ADN tái tổhợp.V.1.6. Phản ứng PCRNgoài các kỹ thuật tách dòng vàkhuếch đại gen sử dụng các loại tếbào chủ, một phương pháp khuếch đạigen có hiệu quả cao giờ đây đã trởthành một kỹ thuật phổ biến trong hầuhết các nghiên cứu di truyền học phântử là kỹ thuật phản ứng chuỗi trùnghợp PCR (polymerase chain reaction).Đây là một kỹ thuật hóa sinh invitrothuần túy. Kỹ thuật PCR sử dụngenzym ADN polymerase để tổng hợpnên các phân tử ADN mới từ trình tựcủa phân tử ADN làm khuôn với tiềnchất là các deoxyribonucleotit. Cácenzym ADN polymerase tổng hợpADN theo chiều 5’® 3’ và có thể xúctác gắn nucleotit tiếp theo vào phíađầu 3’ của một trình tự oligonucleotitcó sẵn. Nghĩa là, nếu ta có một đoạntrình tự oligonucleotit đã gắn vào mộtmạch ADN làm khuôn có trình tự bổsung với trình tự của đoạnoligonucleotit, thì enzym ADNpolymerase có thể sử dụng đoạnoligonucleotit đó làm đoạn mồi vàtiếp tục kéo dài chuỗi ADN về phíađầu 3’ dựa trên trình tự của mạchADN làm khuôn.Vậy, bằng cách nào người ta có thể sửdụng phản ứng PCR và enzym ADNpolymerase để khuếch đại một đoạntrình tự ADN đặc hiệu ? Người ta sẽtổng hợp và sử dụng hai đoạnoligonuleotit. Đoạn thứ nhất có trìnhtự bổ sung với đầu 5’ của một mạchphân đoạn ADN cần khuếch đại (đoạnnày gọi là mồi xuôi), còn đoạn trìnhtự thứ hai bổ sung với đầu 5’ củamạch đối diện (mồi ngược). Phân tửADN làm khuôn sẽ được làm biếntính (bởi nhiệt) và các mồi xuôi vàmôi ngược sẽ gắn vào trình tự bổ sungở hai đầu đoạn ADN cần khuếch đại.Với sự có mặt của các cơ chất là cácdeoxyribonucleotit, enzym ADNpolymerase sẽ tổng hợp và kéo dàimột mạch phân tử ADN bắt đầu từ haiđoạn mồi.Trong chu kỳ tiếp theo, phân tử ADNlại được gây biến tính và quá trìnhtổng hợp ADN được lặp lại với cùngc ...