Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn Hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt Nam

Bài viết nghiên cứu chế tạo kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo đơn giá và gây miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn Hổ mèo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn Hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt NamTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNGHUYẾT THANH NGỰA ĐƠN ĐẶC HIỆU KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Najasiamensis) TẠI VIỆT NAMLê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm**; Hoàng Anh Tuấn***TÓM TẮTMục tiêu: nghiên cứu chế tạo kháng nguyên (KN) nọc rắn Hổ mèo (RHM) đơn giá và gâymiễn dịch cho ngựa tạo kháng thể (KT) đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuấthuyết thanh kháng nọc (HTKN) RHM. Phương pháp: chế tạo KN nọc RHM từ nọc tổng số theophương pháp giảm độc lực, gây miễn dịch cho ngựa theo phương pháp tiêm dưới da nhiều mũiliều thấp nhắc lại nhiều lần. Kết quả: tạo được 300 ml KN chuẩn, xác lập lịch trình gây miễndịch thành công cho ngựa và thu được huyết tương có KT đặc hiệu làm nguyên liệu chế tạoHTKN RHM đơn đặc hiệu. Kết luận: đã tạo được KN chuẩn và gây miễn dịch thành công chongựa thu được huyết tương có KT đặc hiệu.* Từ khóa: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis); Kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo; Huyết thanh khángnọc rắn Hổ mèo.Study of Antigen Production and Immunization Created HorseMonospecific Antiserum Against Indochinese Spitting Cobra (Najasiamensis) Venom in VietnamSummaryObjectives: To prepare Naja siamensis (NS) monovalent antigen and to immunize horse for theproduction of NS monospecific antibody. Methods: NS monovalent venom antigen was preparedfrom whole venom by detoxification method; horse hyper-immunization was done by subcutaneousmultiple site and repeated low dose injections. Results: 300 ml of standard antigen was prepared,immunization for horse against NS venom and collected hyperimmune was establishedsuccesfully. Horse plasma containing specific antibody has been obtained as a material for NSmonospecific antivenom production. Conclusion: NS standard antigen has been succesfullyprepared and used for immunization of horse to produce specific antibody in horse plasma.* Key words: Naja siamensis; Naja siamensis antigen; Naja siamensis antivenom.ĐẶT VẤN ĐỀRắn độc cắn vẫn là mối hiểm họa chocác quốc gia đang phát triển vùng nhiệtđới ở châu Phi, châu Á và Mỹ Latinh, trongđó có Việt Nam. Năm 2008, Tổ chức Y tếThế giới (WHO) xếp bệnh lý rắn độc cắnvào các bệnh lý “Nhiệt đới bị lãng quên” [8].* Bệnh viện FV** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn*** Học viện Quân yNgười phản hồi (Corresponding): Lª Kh¾c QuyÕn (lekhacquyen@yahoo.com)Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/01/2015Ngày bài báo được đăng: 29/01/201543TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015Việt Nam là quốc gia đầu tiên trên thế giớisản xuất và điều trị HTKN rắn Hổ từ nghiêncứu của A. Calmette tại Viện Pasteur SàiGòn năm 1894 [5]. Hơn 100 năm sau,Việt Nam vẫn chưa tự sản xuất đượcHTKN rắn. Ước tính có đến 30.000trường hợp bị rắn cắn mỗi năm. Từ năm1990, Trịnh Xuân Kiếm và CS đã nghiêncứu phát triển kỹ thuật sản xuất HTKNrắn [2, 4]. Hiện nay chúng ta có được cácloại HTKN rắn Chàm quạp, Hổ đất, rắnLục, Cạp nia và Hổ chúa. Tỷ lệ tử vongđã giảm từ 19,5% lúc chưa có huyết thanhxuống còn 3,1% sau điều trị HTKN đơnđặc hiệu [4].Rắn Hổ mèo thường gây tai nạn chobệnh nhân (BN) sinh sống ở vùng ĐôngNam Bộ, nhiều trường hợp tử vong hoặcđể lại thương tật nặng nề như cắt cụt chihoặc mất da rộng gây sẹo co rút mất khảnăng lao động. Việc điều trị hiện nay chủyếu là điều trị triệu chứng do chưa cóHTKN đặc hiệu [6]. Nghiên cứu sản xuấtHTKN RHM là cần thiết và yêu cầu cấpbách trong vấn đề cứu chữa người bịRHM cắn. Do đó, yêu cầu đặt ra là chếtạo được KN, xác lập quy trình lịch gâymiễn dịch cho động vật lớn như ngựa đểtạo huyết thanh ngựa có KT kháng nọcRHM với hiệu giá cao, làm nguyên liệutiến tới sản xuất HTKN RHM đầu tiên tạiViệt Nam.ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.- Rắn Hổ mèo: 50 cá thể thu nhậntrong điều kiện tự nhiên tại khu vực miềnĐông Nam Bộ, kích thước từ 0,2 - 1,5 m,44nặng từ 100 g - 2,5 kg, màu vàng nhạtoliu hoặc màu vàng nhạt trắng. Rắn cóthể bạnh mang và phun nọc độc xa tới 2m. Mặt lưng cổ phình mang có 2 vòngtròn nối với nhau theo hình chữ U hoặc V:2 mắt kính nhưng không có gọng kính,phía mang vùng bụng có 2 đốm đen và1 - 2 khoang đen.Hình 1: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis).- Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực 5tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300 kg, dùngđể gây miễn dịch.2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu.- Dung dịch PBS 10%, glutaraldehyd 20%,methanol, thạch agarose, thuốc nhuộmcoomasie blue 0,025%, axit acetic, máyđo pH, bộ lọc vô khuẩn, lọ vô khuẩn, tủấm, phiến kính, nước cất vô trùng, kimtiêm vô trùng.- Môi trường cấy vi khuẩn Sabouraud,thioglycolat và nấm.- Tá chất Freund hoàn chỉnh (CompleteFreund Adjuvant - CFA) và tá chất Freundkhông hoàn chỉnh (Incomplete FreundAdjuvant - IFA) (Hãng Sigma, Mỹ).TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-20153. Phương pháp nghiên cứu.Nghiên cứu thực nghiệm trong phòngthí nghiệm và trên động vật.* Thu nhận nọc rắn:Thu nhận nọc RHM theo hướng dẫncủa Tổ chức Y tế Thế giới bằng phươngpháp kích thích cơ học vào hai bên tuyếnnọc để rắn nhả nọc vào đĩa petri vô trùng.Trộn đều hỗn hợp nọc của 50 cá thể rắnđể bảo đảm tính đại diện loài và địaphương phân bố của rắn [8]. Ly tâm bỏcặn hỗn hợp nọc, sau đó bảo quản ở-20ºC liên tục đến khi sử dụng.* Chế tạo KN:Chế tạo KN nọc RHM đơn giá theo kỹthuật khử nọc rắn độc bằng dung dịchglutaraldehyd, sau đó dùng phương phápnhiệt để tạo KN đặc hiệu [8]. Kiểm địnhtính vô trùng KN nọc RHM bằng các xétnghiệm vi sinh thường quy.* Gây miễn dịch cho ngựa:Được thực hiện theo kinh nghiệm trongsản xuất HTKN rắn Hổ đất của TrịnhXuân Kiếm và CS (1997) [4] và hướngdẫn của WHO (2010) [8]. Ngựa được gâymiễn dịch bằng cách tiêm dưới da lặp lạinhiều lần liều thấp KN nọc RHM đơn giáphối trộn với tá chất miễn dịch Freundhoàn chỉnh và không hoàn chỉnh, tăngdần ...