Nghiên cứu chuyển gen vào một số giống khoai lang Việt Nam (Ipomea batatas L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả đánh giá hiệu quả chuyển gen Gus vào sáu giống khoai lang (Chiêm Dâu, Hoàng long, KB1, KLC266, Tự nhiên, VĐ1) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thông qua biểu hiện tạm thời của gen Gus ở các mẫu thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các giống khoai lang nghiên cứu đều có tỉ lệ Gus dương tính ở các mẫu thí nghiệm là khá cao và không có sự khác biệt rõ rệt về sự hiểu hiện tạm thời của gen Gus giữa các giống.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu chuyển gen vào một số giống khoai lang Việt Nam (Ipomea batatas L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensVũ Thị Lan và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ96(08): 119 - 124NGHIÊN CỨU CHUYỂN GENVÀO MỘT SỐ GIỐNG KHOAI LANG VIỆT NAM (IPOMEA BATATAS L.)THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENSVũ Thị Lan1, 2*, Mai Thị Phương Nga2,Phạm Bích Ngọc2, Chu Hoàng Hà2, Lê Trần Bình21Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên; 2Viện Công nghệ Sinh họcTÓM TẮTTrong bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả đánh giá hiệu quả chuyển gen Gus vào sáugiống khoai lang (Chiêm Dâu, Hoàng long, KB1, KLC266, Tự nhiên, VĐ1) nhờ vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens thông qua biểu hiện tạm thời của gen Gus ở các mẫu thí nghiệm. Kếtquả nghiên cứu cho thấy, các giống khoai lang nghiên cứu đều có tỉ lệ Gus dương tính ở các mẫuthí nghiệm là khá cao và không có sự khác biệt rõ rệt về sự hiểu hiện tạm thời của gen Gus giữacác giống. Tuy nhiên, tỉ lệ chuyển gen giữa các chủng vi khuẩn là khác nhau, C58/pGV2260 vàEHA105 cho kết quả chuyển gen cao hơn LBA 4404 và phù hợp cho chuyển gen vào một số giốngkhoai lang Việt Nam. Các mảnh cấy có nguồn gốc khác nhau từ cây có độ tuổi khác nhau cũngđược nghiên cứu, kết quả các mảnh cấy từ đỉnh chồi có sự biểu hiện tạm thời của gen Gus cao hơnso với các mảnh cấy từ mảnh lá và cuống lá.Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen, giống, Ipomoea batatas L., nhuộm GusMỞ ĐẦU*Khoai lang (Ipomoea batatas L.) thuộc họKhoai lang (Convolvulaceae). Khoai lang làcây hai lá mầm và là cây trồng lục bội với sốbội thể 2n= 90 [4]. Ở nước ta, khoai lang làcây trồng chiếm một vị trí quan trọng trongsản xuất lương thực, đứng thứ 3 sau lúa vàngô. Tuy nhiên, sản xuất khoai lang bị hạnchế bởi những thiệt hại nghiêm trọng do côntrùng và sâu bệnh. Vì vậy, hướng ứng dụngcác phương pháp công nghệ sinh học hiện đạiđể chuyển các gen của vi khuẩn Bt vào câykhoai lang để tạo giống mới có khả năngkháng lại sâu bệnh và côn trùng đang rất đượcquan tâm.Hiện nay, các nhà chọn tạo giống khoai langViệt Nam đã chọn ra nhiều giống mới có triểnvọng như: Giống số 8, K51, KL5, KB1, TV1,H.1.2, giống khoai lang cực nhanh, giốngkhoai lang 143. Ngoài ra, một số giống khoailang địa phương cũng có chất lượng tốt, đượcngười tiêu dùng ưa chuộng như: Hoàng long,Chiêm dâu, Lim, Bí, Đà Nẵng…[3]. Chính vìvậy, chúng tôi tiến hành khảo sát trong tậpđoàn giống khoai lang để lựa chọn ra một số*Tel: 0914 504250, Email: lanvtdhkhtn@gmail.comgiống có khả năng tái sinh tốt và có khả năngtiếp nhận gen bằng phương pháp chuyển genthông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacienphục vụ việc chuyển gen kháng bọ hà ởkhoai lang.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨUVật liệu nghiên cứu là đỉnh sinh trưởng,mảnh lá, cuống lá của sáu giống khoai nuôicấy in vitro gồm Chiêm Dâu, Hoàng long,KB1, KLC266, Tự nhiên, VĐ1.Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefacienssử dụng gồm chủng EHA105, C58/pGV2260,LBA 4404 mang gen chỉ thị Gus để kiểm trabiểu hiện tạm thời của gen và gen nptII khángkanamycin để chọn lọc tế bào chuyển gen.Vật liệu và chủng vi khuẩn sử dụng do phòngCông nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệsinh học, Viện Khoa học và Công nghệ ViệtNam cung cấp.Phương pháp nghiên cứu:Tạo dịch huyền phù AgrobacteriumtumefaciensCấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerollên đĩa môi trường LB thạch có bổ sungkháng sinh phù hợp, nuôi ở 28oC trong 48 119Vũ Thị Lan và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ96 giờ. Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩnnuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sungkháng sinh phù hợp và nuôi lắc ở tốc độ 220vòng/phút ở 28oC. Sau 8 - 12 giờ, lấy dịchhuyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm vớitốc độ 4500 vòng/ phút, ở 4oC trong 10 phút.Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môitrường 1/2 MS và pha loãng cho tớiOD600 ≈ 0,6 - 0.8. Dịch huyền phù vi khuẩnnày có thể được sử dụng để biến nạp ngay haycó thể giữ ở 4 oC trong 1 - 2 giờ.Nhiễm vi khuẩn và đồng nuôi cấyNguyên liệu sau khi cắt nhỏ được ngâm trongdịch huyền phù vi khuẩn khoảng 30 phút vàđược đặt lên môi trường cộng sinh và nuôitrong tối ba ngày, ở nhiệt độ 26oC ± 2 oC.Phân tích sự biểu hiện tạm thời của genGus (Theo phương pháp của Jefferson &CS, 1987)Các mảnh cấy sau ba ngày nuôi cộng sinhđược nhuộm với dung dịch 5-bromo-4chloro-3-indolyl glucuronide (X-gluc), để 812 giờ trong tối ở nhiệt độ 37 oC. Sau đó rửabằng cồn 70 % ba lần và quan sát dưới kínhhiển vi. Những vùng có gen Gus nhuộm màuxanh lam [1].Phương pháp bố trí thí nghiệm:+ Ảnh hưởng của chủng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens đến sự biểu hiệntạm thời của gen Gus của sáu giống khoailang: Chuyển gen Gus đối với ba chủng vikhuẩn A. tumefaciens là C58/pGV2260,EHA105 và LBA4404 chứa vector mang genGus (pCB-Gusplus).+ Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiệntạm thời của gen Gus ở sáu giống khoai lang:Mảnh lá, cuống lá, đỉnh chồi từ cây khoai invitro ở hai loại độ tuổi khác nhau là chồi câyin vitro ở thí ...