Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tinh sạch enzyme butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp

Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp, nghiên cứu này tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tinh sạch enzyme butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp Hóa học – Sinh học – Môi trường NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ TINH SẠCH ENZYME BUTYRYLCHOLINESTERASE (EC 3.1.1.8) TÁI TỔ HỢP Nghiêm Ngọc Hoa1, Nguyễn Hà Trung1, Nguyễn Duy Hưng2, Nguyễn Vũ Minh Hạnh3, Phạm Kiên Cường1* Tóm tắt: Butyrylcholinesterase (BuChE) là một esterase serine. Tác dụng chính của BuChE là xúc tác quá trình thủy phân các este cholin tạo thành cholin và axit cacboxylic. Enzyme này bị ức chế mạnh bởi các hợp chất cơ phospho và các tác nhân thần kinh. Trong nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein BuChE tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 trong điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25 mM, sau thời gian 3 giờ ở 37oC. BuChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa có hoạt độ là 3,58 U/mg protein. Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch. Dịch enyzme thô được chiết trong đệm phosphate 20 mM, pH 8, được lọc qua màng lọc có kích thước 100 kDa. Dịch trên màng được tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký khác nhau: sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của protein BuChE cho thấy, việc s dụng cột trao đổi ion để tinh sạch protein BuChE cho hiệu suất cao nhất. Các phân đoạn có hoạt tính được cô qua màng 100 kDa, enyzme sau tinh sạch có hoạt tính riêng 120 U/mg pr.Từ khóa: Enzyme; Butyrylcholinesterase; Tinh sạch. 1. MỞ ĐẦU Nhằm thu nhận được một lượng lớn enzyme butyrylcholinesterase dùng cho mục đíchphân tích hoặc trị liệu cũng như nghiên cứu rất nhiều thông tin về cấu trúc và chức năngcủa enzyme, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu biểu hiện enzyme này dưới dạng táitổ hợp [4, 6, 7]. Năm 2012, Brazzolotto và cộng sự đã tiến hành biểu hiện gen mã hóa chobutyrylcholinesterase của người trong Drosophila melanogaster. Protein tạo ra có khảnăng glycosyl hóa cao với năng suất cao hơn 4 lần so với biểu hiện trong tế bào CHO (tếbào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc). Nhóm tác giả cũng đưa ra phương pháptinh sạch protein dựa trên sắc ký ái lực huprine nhằm thu được protein tinh khiết với hiệusuất cao hơn. Năm 2015, Tian và cộng sự đã biểu hiện thành công butyrylcholinesterasecủa người (hBuChE) sau tối ưu hóa codon trên nấm men Pichia pastoris dòng GS115.hBuChE tái tổ hợp thu được có nồng độ protein tổng số đạt 292 mg/ml với hoạt độ 14,7U/ml; sau tinh sạch thu được enzyme có hoạt độ riêng 8,1 U/mg với hiệu suất 68% [7]. Trong nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein BuChE tái tổ hợptrong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 trong điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25mM, sau thờigian 3 giờ ở 37oC. BuChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa có hoạt độ là 3,58U/mg protein. Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp,trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưuhóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1. Nguyên liệu và hóa chất Chủng vi khuẩn BL21- CodonPlus (DE3)- RIL mang vector pET43a-BuChE; IPTG,Butyrylthiocholine Iodide từ hãng Sigma-Aldrich; thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng414 N. N. Hoa, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ … (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp.”Nghiên cứu khoa học công nghệcho SDS-PAGE được mua từ hãng Enzynomics; thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng chothẩm tách miễn dịch, NBT, BCIP và màng SnakeSkin của hãng Thermo Fisher Scientific,màng PVDF, kháng thể đơn dòng kháng BuChE chuột của hãng Millipore; kháng thể thứcấp kháng IgG chuột của hãng Promega; gel Ni-sepharose của hãng Qiagen; gel DEAE-sepharose, gel sephadex G75, G100 của hãng GE; màng lọc tiếp tuyến kích thước 50 kDa,100 kDa; 0,2 µm và một số hóa chất cần thiết khác dùng trong nghiên cứu được mua từcác hãng hóa chất uy tín trên thế giới.2.2. Thiết bị Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt, máy phá tế bào, thiết bị điện di đứng, máyđiện chuyển ướt, máy ly tâm Sigma 3K, máy ly tâm 5417 R, máy khuấy từ, máy đo quangphổ kế, máy Nanodrop. Hệ thống lọc tiếp tuyến và hệ thống máy sắc ký tự động AKATAPrime Plus của GE.2.3. Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu2.3.1. Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở bước sóngλ=280 nm và theo phương pháp của Lowry và cộng sự [5] với tinh thể albumin huyếtthanh bò làm đường chuẩn.2.3.2. Xác định hoạt độ Enzyme butyrylcholinesterase Hoạt tính của enzyme butyrylcholinesterase được xác định theo phương pháp củaEllman và c ...