Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ một tế bào bằng phương pháp nested-PCR và enzym giới hạn

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt từ 1 tế bào bạch cầu, tách từ máu ngoại vi của các gia đình bệnh nhân, là cơ sở trong chẩn đoán tiền làm tổ bệnh teo cơ tủy.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ một tế bào bằng phương pháp nested-PCR và enzym giới hạn Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen smnt gây bệnh teo cơ tủy từ một tế bào bằng phương pháp nested-pcr và enzym giới hạn Nguyễn Thị Thanh Nga*; Nguyễn Đình Tảo* Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Vũ Chí Dũng** Tóm tắt Mục tiêu: hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt từ 1 tế bào (TB), là cơ sở trong chẩn đoán tiền làm tổ bệnh teo cơ tủy. Đối tượng và phương pháp: 4 gia đình sinh con bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7, 8 gen SMNt. Lấy máu tĩnh mạch của bố, mẹ, con mỗi gia đình, sau đó tách và lấy 1 TB bạch cầu, ly giải TB, tiến hành phản ứng nested-PCR nhân exon 7, 8 gen SMNt, ủ sản phẩm PCR với enzym DraI và DdeI. Điện di sản phẩm cắt trên gen agarose 3% và phân tích kết quả. Kết quả: cả 4 bệnh nhân (BN) đều mất đồng hợp exon 7, 8 gen SMNt, kết quả này phù hợp với chẩn đoán gen từ mẫu máu toàn phần. Kết luận: đã xây dựng được quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ 1 TB. * Từ khóa: Teo cơ tủy; Gen SMN, SMA; Nested-PCR; 1 tế bào. Completing Assays for Detecting SMNt Gene Mutation in Single Cell using Nested-PCR and Restriction Enzyme Method Summary Objective: Seting up a molecular diagnostic protocol for detecting spinal muscular atrophy (SMNt) mutation in single cell is basic to preimplantation gentic diagnosis. Subjects and methods: This study was carried out on 4 patients and their parent. Lymphocytes of patients and their parent were isolated from fresh blood by ficoll. Taking a lymphocyte by stereoscopic microscope, lysised the cell, amplifying exon 7 and exon 8 of SMNt gene by using a nested polymerase chain reaction, followed by DraI and DdeI restriction digest enzyme of the PCR enabling the important SMNt gene to be distinguished from the centromic SMNc gene which has no clinical phenotype to detect mutation. Electrophoresis PCR products after digesting by restriction enzyme and analysis. Result: 4 patients showed deletion in exon 7 and exon 8 SMNt gene. This result is similar with the gene diagnosed from fresh blood. Conclusion: We have successfully applied the technique of nested-PCR for the gene diagnosis of spinal muscular atrophy from single cell. * Key words: Spinal muscular atrophy; SMN gene; Nested-PCR; Single cell. * Học viện Quân y ** Bệnh viện Nhi Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Thanh Nga (thanhngabongbong81@gmail.com) Ngày nhận bài: 13/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2014 Ngày bài báo được đăng: 27/01/2015 96 Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015 Đặt vấn đề Bệnh teo cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy - SMA) là bệnh thần kinh cơ đặc trưng do các TB sừng trước tuỷ sống thoái hoá tuần tiến, dẫn đến yếu cơ đối xứng gốc chi, trương lực cơ và phản xạ gân xương bị giảm hoặc mất. Tỷ lệ bệnh SMA chung trên toàn thế giới là 1/10.000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen bệnh dao động từ 1/40 - 1/60 [4, 5, 7]. Nguyên nhân gây bệnh SMA là do đột biến gen SMNt (survival monitor neurone) trên nhiễm sắc thể số 5. Gen SMN bao gồm 9 exon mã hoá cho phân tử protein SMN dài 294 axít amin. Gen SMN có hai bản sao giống nhau là gen SMNt (SMN1) và gen SMNc (SMN2). Trong đó, chỉ khi gen SMNt bị đột biến mới gây bệnh SMA. Hai gen này chỉ khác nhau ở 5 cặp base: một cặp ở intron 6, một cặp ở exon 7, hai cặp ở intron 7 và một cặp ở exon 8, nên khi nhân gen SMNt sẽ nhân luôn cả gen SMNc. Vì vậy, sự khác nhau ở exon 7 và exon 8 được sử dụng để phân biệt gen SMNt với SMNc trong chẩn đoán SMA [10]. Khoảng 95% BN SMA bị đột biến mất đồng hợp exon 7, 8 gen SMNt, còn 5% BN SMA bị đột biến điểm gen SMNt. Vì vậy, để chẩn đoán gen bệnh SMA, thường phân tích sự có mặt hay không có mặt exon 7, 8 gen SMNt [1, 5, 6, 8, 10]. Mỗi trẻ em mắc bệnh SMA ra đời là gánh nặng cho gia đình về tâm lý và tài chính, đồng thời cũng là gánh nặng cho toàn xã hội. Do đó, việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (preimplantation genetic diagnosis - PGD) bệnh SMA với gia đình tiền sử có người mắc bệnh SMA nhằm chọn ra những phôi lành để cấy chuyển vào tử cung mẹ, từ đó sinh ra những em bé khỏe mạnh là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng [2, 3]. 98 Chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm: Hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ 1 TB bạch cầu, tách từ máu ngoại vi của các gia đình BN. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu. Chọn 4 gia đình có con độ tuổi từ 0 - 18 đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương, đã được chẩn đoán bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Tách và hút bạch cầu từ mẫu máu ngoại vi: - Tách TB bạch cầu từ máu toàn phần theo protocol Ficoll - paque. Sau đó, tiến hành hút TB bạch cầu từ mẫu bạch cầu đã tách theo các bước sau: + Bước 1: hút 5 giọt dung dịch PBS1X (20 μl) đặt lần lượt lên một lam kính đã rửa sạch, đánh số thứ ...