Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm Epstein-Barr virus và tính chất methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u ở bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam

Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH). Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâm nhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm Epstein-Barr virus và tính chất methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u ở bệnh nhân ung thư vòm họng Việt NamGiải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TÍNH CHẤT XÂM NHIỄMEPSTEIN-BARR VIRUS VÀ TÍNH CHẤT METHYL HÓA VƯỢT MỨC TRÊN GENE ỨC CHẾ KHỐI U Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG VIỆT NAM Phan Thị Hiếu Nghĩa*, Bùi Thị Nhã Phương, Nguyễn Văn Yên, Lâm Hồng Ngọc Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh * Tác giả liên hệ: hieunghia189@gmail.com TÓM TẮTEpstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hainguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH). Mục tiêu chính của nghiên cứu nàylà xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâmnhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u. Trong nghiêncứu này, chúng tôi đã xây dựng cơ sở dữ liệu cho thực nghiệm phát hiện sớm UTVH dựa trênhai yếu tố xâm nhiễm EBV và methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u bằng kỹ thuậtPCR và MSP với các cặp mồi được đánh giá tốt về mặt lý thuyết. Về mặt thực nghiệm, chúngtôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2 củaEBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của các gene ức chế khối u E-cadherin và Blu trên các mẫu bệnh phẩm. Sự hiện diện các gene mục tiêu của EBV và tínhchất methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu có mối tương quan có ý nghĩa với sự hìnhthành và phát triển khối u vòm họng (pGiải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa họccao nhất khu vực Đông Nam Á (Mahdavifar mục tiêu thiết lập cơ sở dữ liệu, xây dựnget al., 2016). Cụ thể, theo thống kê của quy trình phát hiện đồng thời EBV và tínhGlobocan vào năm 2012, tỷ lệ mắc bệnh chất methyl hóa trên các gene ức chế khối uUTVH là 3,9% và tỷ lệ tử vong do UTVH là E-cadherin, Blu trên bệnh UTVH; đánh giá3,0%. Các phương pháp chẩn đoán UTVH mối tương quan giữa tính chất nhiễm EBV vàhiện nay chủ yếu dựa vào các triệu chứng methyl hóa trên các gene E-cadherin và Blulâm sàng, nội soi vòm họng, xét nghiệm mô trong quá trình hình thành bệnh UTVH; từbệnh học, chẩn đoán huyết thanh EBV… Tuy đó, hướng đến xây dựng một kỹ thuật chẩnnhiên, khi phát hiện UTVH bằng các phương đoán sớm UTVH.pháp này thì khối u vòm họng đã phát triểnđến một mức độ nhất định. Do đó, việc xây VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPdựng một phương pháp tiên lượng, chẩn đoán Thu nhận mẫusớm UTVH là một yêu cầu cấp thiết nhằm Tổng số 50 mẫu gồm 36 mẫu mô sinh thiếttầm soát UTVH, đưa ra những biện pháp UTVH và 14 mẫu dịch phết lành do Bệnhđiều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị và viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh cungtỷ lệ sống sót ở bệnh nhân UTVH. cấp năm 2015. Các mẫu này được bảo quảnEpstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa trong dung dịch PBS ở -20oC.vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai Tách chiết DNA, biến đổi bisulfite, phảnnguyên quan trọng gây bệnh UTVH (Chu et ứng PCR, MSPal., 2008; Thompson et al., 2004; Tsao et al., DNA được tách chiết bằng phương pháp2014). EBV xâm nhiễm, tồn tại, nhân lên và Phenol/Chloroform theo quy trình tách chiếtgây bệnh cho tế bào chủ nhờ vào sự hoạt của Chomczynski và Sacchi (1987) có thayđộng của các gene thuộc họ EBNAs (EBNA1, đổi chỉ số pH của phenol từ 4 thành 8. DNAEBNA2, EBNA3), LMPs (LMP1, LMP2), … sau tách chiết được chia làm 2 phần: 1 phần(Chou et al., 2008; Korcum et al., 2006). Bên dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCRcạnh đó, theo nghiên cứu của Tsai và cộng sự khuếch đại các gene mục tiêu của EBV, phần(2002), EBV còn có khả năng gây ung thư còn lại sẽ được xử lý bằng bộ kit biến đổigián tiếp qua bất hoạt sự hoạt động một số bisulfite MethylEdge® của hãng Promega, rồigene ức chế khối u của tế bào chủ. Cụ thể, tiến hành phản ứng MSP để khảo sát sựtrong nghiên cứu này, protein LMP1 của methyl hóa của các gene ức chế khối u. SảnEBV được chứng minh có chức năng hoạt phẩm PCR, MSP được điện di trên gelhóa de novo methyltransferase dẫn đến sự agarose 1,5%.methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của Phân tích kết quả thực nghiệmEcadherin, từ đó ức chế biểu hiện gene này. Tần số phát hiện các gene EBNA1, EBNA2,Trong các gene ức chế khối u, Ecadherin và LMP1, LMP2 và tần số methyl, unmethyl hóaBlu được chú ý đến bởi đây là các gene có các gene E-cadherin, Blu được tính toán vàchức năng điều tiết các quá trình sinh học cơ so sánh bằng phương pháp kiểm định Chibản của tế bào như sự di chuyển, tăng sinh, bình phương (Chi-square test). Sự khác biệtbiệt hóa, chết theo chương trình tế bào về tần số các gene giữa các nhóm được xem(apoptosis) và đóng vai trò quan trọng trong là có ý nghĩa với p ≤ 0,05. Bên cạnh đó, cácviệc ức chế sự tăng sinh của tế bào khối u ác giá trị tỷ suất chênh (OR), nguy cơ (RR)…tính. Sự methyl hóa bất thường trên các gene cũng được tính toán bằng phần mềmức chế khối u E-cadherin, Blu đã được chứng Medcalc®version 16.minh là nguyên nhân hình thành, phát triểnvà di căn tế bào UTVH (Bossche et al., 2012; KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNHutajulu et al., 2011; Richards et al., 2006; K ...