Nghiên cứu sự biểu hiện tạm thời của kháng nguyên H7 của virus cúm A H7N9 trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) bằng phương pháp agro infiltration

Dịch chiết protein từ lá thuốc lá mang các loại kháng nguyên này được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu. Kết quả cho thấy rằng, dịch chiết protein kháng nguyên (H7pII-ELP)3 là có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ở nồng độ protein 94 µg/ml, trong khi đó dịch chiết protein H7-ELP lại không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu tại nồng độ protein đó. Mời các bạn tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu sự biểu hiện tạm thời của kháng nguyên H7 của virus cúm A H7N9 trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) bằng phương pháp agro infiltrationTạp chí Công nghệ Sinh học 15(1): 133-140, 2017NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN TẠM THỜI CỦA KHÁNG NGUYÊN H7 CỦA VIRUS CÚMA/H7N9 TRONG CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA BENTHAMIANA) BẰNG PHƯƠNGPHÁP AGRO-INFILTRATIONLê Thị Thủy, Lê Thu Ngọc, Hồ Thị Thương, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Chu Hoàng HàViện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt NamNgười chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: pbngoc@ibt.ac.vnNgày nhận bài: 30.9.2015Ngày nhận đăng: 29.11.2016TÓM TẮTCúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới, có khả năng lây bệnh trên người được phát hiện tại TrungQuốc vào năm 2013. Protein bề mặt Hemagglutinin của virus cúm được xem như là mục tiêu hàng đầu dùng đểthiết kế vacxin chống lại sự xâm nhiễm của virus cúm A/H7N9. Trong nghiên cứu này, đoạn gen mã hóa choprotein H7 của virus cúm A/H7N9 đã được nhân dòng vào 2 vector pRTRA dưới sự điều khiển của promoterCaMV35S để gắn kết ELP, tạo thành 35S-H7-histag-cmyc-ELP-KDEL và 35S-H7pII-histag-cmyc-ELP-KDELtương ứng khi không có mặt và có mặt trimer motif GCN4. Các cassette này sau đó đã được ghép nối vàovector chuyển gen pCB301 và biến nạp vào A. tumefaciens để chuyển vào lá cây thuốc lá Nicotianabenthamiana bằng phương pháp Agro-infiltration. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein H7 từ mẫu lá sau 5ngày biến nạp bằng lai miễn dịch cho thấy có sự biểu hiện thành công của các protein tái tổ hợp H7-ELP và(H7pII-ELP)3. Điều này cho thấy rằng gen mã hóa protein H7 của virus cúm A/H7N9 đã được gắn thành côngvào 2 vector chuyển gen và được biểu hiện dưới dạng đơn H7-ELP và dạng ba (H7pII-ELP)3 trong cây thuốc láN. benthamiana. Dịch chiết protein từ lá thuốc lá mang các loại kháng nguyên này được sử dụng để đánh giáhoạt tính sinh học bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu. Kết quả cho thấy rằng, dịch chiết protein kháng nguyên(H7pII-ELP)3 là có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ở nồng độ protein 94 µg/ml, trong khi đó dịch chiếtprotein H7-ELP lại không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu tại nồng độ protein đó.Từ khóa: biểu hiện tạm thời, Hemagglutinin (HA), Nicotiana benthamiana, protein tái tổ hợp, virus cúmA/H7N9.MỞ ĐẦUCúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mớiđược phát hiện tại Trung Quốc với độc lực cao.Thông thường, virus cúm A phân nhóm H7 thườnggây bệnh trên gia cầm, tuy nhiên một số biến thể cóthể gây bệnh sang người khi tiếp xúc trực tiếp vớigia cầm nhiễm bệnh, ví dụ như subtype H7N2,H7N3 và H7N5 đã gây tử vong cho con người(Campbell et al., 1970; Tweed et al., 2004). Chủngvirus H7N9 trước đây đã từng xuất hiện nhưng chỉgây ra dịch bệnh trên chim tại Hà Lan, Nhật Bản vàHoa Kỳ. Ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầmA/H7N9 đầu tiên trên người được phát hiện và côngbố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc vào ngày31/3/2013 (WHO, 2013).Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là (-ss) RNA.Kích thước hệ gen cúm A/H7N9 là 13.090nucleotide và có cấu trúc phân thành 8 phân đoạn mãhóa cho 11 protein, mỗi phân đoạn mã hoá cho mộtchuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các proteinchức năng của virus. Phân đoạn 1 đến 3 mã hóa choprotein PB2, PB1 và PA, là các protein có chức nănglà enzyme polymerase. Phân đoạn 4 mã hóa choprotein HA. HA của virus cúm A là một loại proteingây ngưng kết hồng cầu, được acylat hoá ở vùnggiáp ranh với vỏ virus và có đầu N liên kết glycan ởmột số vị trí nhất định (Swayne, 2008).Những nghiên cứu về vacxin chống lại viruscúm A bắt đầu từ thập nên 90 và cho đến nay có rấtnhiều nghiên cứu về kháng nguyên HA đã được biểuhiện thành công trên thực vật. Trong nhiều hướngứng dụng để phát triển các loại vacxin tiểu đơn vịchống virus cúm A, protein HA được xem như làmục tiêu hàng đầu dùng để thiết kế loại vacxin nàychống lại sự xâm nhiễm của virus cúm A. Hướng tạo133Lê Thị Thuỷ et al.vacxin tiểu đơn vị sử dụng hệ thống hiểu hiện ở thựcvật được xem như là một hướng đầy triển vọng vớinhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểuhiện khác như (1) chi phí sản xuất thấp; (2) cho phépthực hiện việc định vị chính xác protein tái tổ hợptrong tế bào, cũng như cho phép protein có nhữngbiến đổi sau dịch mã. Tuy nhiên, protein tái tổ hợpđược tích lũy trong cây trồng chuyển gen thườngkhông cao và thiếu một phương thức tinh sạchprotein tái tổ hợp hiệu quả. Để khắc phục nhượcđiểm này, hiện nay agro-infiltration là phương phápđược ứng dụng trong sinh học thực vật nhằm biểuhiện tạm thời gen hoặc sản xuất các protein tái tổhợp mong muốn. Agro-infiltration được ứng dụngphổ biến nhất trên hai loài thuốc lá Nicotianabenthamiana và Nicotiana tabacum. Phương phápnày rất hữu ích trong biểu hiện của protein đích thựcvật vì phương pháp này nhanh, không bị ảnh hưởngbởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thểtiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàntoàn như lá (Fischer et al., 1999).nguyên H7 được tổng hợp bởi công ty SGIDNA củaThụy Điển; vector pRTRA35S-HA-histag-cmyc100xELP-KDEL và vector pRTRA-35S-H5pIIhistag-cmyc-ELP-KDEL có chứa 100xELP đã đượcthiết kế (Phan et al., 2013); vector chuyển genpCB301 có chứa gen kháng kháng sinh kanamycindựa trên pCB301 của (Xiang et al., 1999) được dùngđể tạo vector chuyển gen mã hóa protein H7-ELP và(H7pII-ELP)3; Vector pMON65305/Hc-Pro chứagen mã hóa cho protein Hc-Pro và gen kháng khángsinh spectinomycin và rifamycin được dùng để đồngbiểu hiện trong thí nghiệm biểu hiện tạm thời vớivector đích tái tổ hợp (Hồ Thị Thương et al., 2014).Promoter điều khiển và phương pháp tinh sạchprotein tái tổ hợp được xem như là một trong nhữngyếu tố quyết định đến hàm lượng kháng nguyên thuđược phục vụ cho việc thử khả năng đáp ứng miễndịch. Nhiều nghiên cứu về sự biểu hiện và sản xuấtthành công kháng nguyên dung hợp His-tag với hàmlượng cao dưới sự điều khiển của promoter CaMV(từ Cauliflower Mosaic Virus) và tinh sạch bằngphương pháp sắc ký ion cố ...