Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến genkras bằng phương pháp PCR đặc hiệu allele tích hợp công nghệ bắt mồi 2 đoạn

Bài viết đặt vấn đề về các biệt dược mang bản chất là kháng thể kháng EGFR đã chứng tỏ được tính hiệu quả trong điều trị ung thư đại trực tràng, tuy nhiên chỉ một bộ phận bệnh nhân không mang đột biến gen kras mới đáp ứng tốt với dược phẩm này. Vì thế cần thiết phải xây dựng được xét nghiệm chẩn đoán chính xác trạng thái đột biến gen kras trên nhóm bệnh nhân có nhu cầu điều trị sử dụng biệt dược này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến genkras bằng phương pháp PCR đặc hiệu allele tích hợp công nghệ bắt mồi 2 đoạn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN KRAS  BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐẶC HIỆU ALLELE TÍCH HỢP CÔNG  NGHỆ BẮT MỒI 2 ĐOẠN  Ngô Tất Trung*, Trần Thị Thanh Huyền*, Lê Hữu Song*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Các biệt dược mang bản chất là kháng thể kháng EGFR đã chứng tỏ được tính hiệu quả trong  điều trị ung thư đại trực tràng, tuy nhiên chỉ một bộ phận bệnh nhân không mang đột biến gen Kras mới đáp  ứng tốt với dược phẩm này. Vì thế cần thiết phải xây dựng được xét nghiệm chẩn đoán chính xác trạng thái đột  biến gen Kras trên nhóm bệnh nhân có nhu cầu điều trị sử dụng biệt dược này.  Vật  liệu  và  phương  pháp:  các  dòng  tế  bào  và  plasmid  mang  các  điểm  đột  biến  khác  nhau  của  Kras,  Sybrgreen I và các vật tư cần thiết cho phản ứng realtime PCR.  Kết quả: Xét nghiệm realtime PCR đặc hiệu allele có tích hợp giải pháp công nghệ bắt mồi hai lần (dual –  priming oligo –DPO) đã được xây dựng thành công, nó cho phép xác định các trạng thái đột biến khác nhau của  gen Kras (34G>T, 34G>C, 34G>A, 35G>T, 35G>C, 35G>A, 38G>A) khi quần thể DNA mang đột biến chiếm ít  nhất  1%  DNA  bệnh  phẩm  (kết  quả  này  tương  đương  với  Therascreen  Kras  mutation  test  kit  do  hãng  DxS  limited Manchester cung cấp). Đồng thời số xét nghiêm được giảm từ bảy (07) xuống còn ba (03) phản ứng vì  thế tiết kiệm được chi phí xét nghiệm.  Kết luận: quy trình chẩn đoán đột biến gen Kras đã được xây dựng thành công  ABSTRACT  SETTING UP A COST EFFECTIVE MOLECULAR DIAGNOSTIC TEST FOR KRAS GENE MUTATION  WITH TECHNIQUE OF ALLENE SPECIFIC REAL TIME PCR COMBINED DUAL PAIRING  OLIGOTIDS  Ngo Tat Trung, Tran Thi Thanh Huyen, Le Huu Song  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 56 ‐ 62  Introduction:  Monoclonal  anti  –  epithelial  growth  factor  receptor  (EGFR)  antibodies  has  gained  FDA’s  approval  for  colorectal  cancer  management,  however,  only  those  habouring  wild  type  Kras  gene  are  clinically  relevant  be  immune‐therapied  by  the  drug.  Which  means,  such  income  –  fitted  molecular  test  for  kras  gene  mutational status is essential in selecting appropriate patients for anti‐EGFR based targeted therapies. Hence we  conducted this study with the aim to establish a cost effective procedure to screen for the seven most abundant  Kras mutational hotspots.  Materials  and  methods:  Colorectal cell lines AND plasmids habouring kras mutant gene sybragreen 1  and are used as positive control. Other material needed for realtime PCR.  Result and conclusion: An allele specific – realtime PCR combined dual – priming oligo (DPO) has been  successfully  established  to  detect  any  of  the  following  kras  gene  mutations  34G>T,  34G>C,  34G>A,  35G>T,  35G>C,  35G>A, 38G>A  when the mutant DNA molecules account for more than 1% patient DNA samples.  Furthermore, PCR reaction number was dropped from seven down to 3, therefore, reducing the laboratory cost  accordingly.  * Khoa sinh học phân tử ‐ Bệnh viện TƯQĐ 108  Tác giả liên lạc: TS. Ngô Tất Trung   ĐT: 0919119416  Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  Email: ntatrung@yahoo.com   55 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Conclusion: We have succeeded implementing the molecular diagnostic test for Kras gene mutation.  Key words: kras, colorectal cancer, personalized medicine  ĐẶT VẤN ĐỀ  Theo  báo  cáo  của  tổ  chức  Y  tế  thế  giới  (chương  trình  globalcan)  và  thống  kê  của  viện  ung thư thuộc viện sức khỏe quốc gia Mỹ: ung  thư đại trực tràng (UTDTT) là nguyên nhân gây  tử vong đứng hàng thứ 2 sau ung thư phổi. Tuy  nhiên  tần  suất  của  bệnh  này  thay  đổi  giữa  các  vùng  địa  lý  khác  nhau:  cao  nhất  là  ở  bắc  Mỹ,  châu Âu sau đó đến khu vực châu Á. Ở nước ta,  tỷ  lệ  tử  vong  do  ung  thư  đại  trực  tràng  đứng  hàng  thứ  4  trong  số  các  bệnh  lý  ung  thư,  nó  chiếm tỷ lệ từ 5‐15% tùy từng khu vực dân cư.  Một  trong  những  đặc  điểm  nổi  bật  của  UTDTT là có sự biểu hiện cao của thụ thể tăng  trưởng  biểu  mô  (epidermal  growth  factor  receptor‐EGFR).  Nghiên  cứu  cho  thấy  có  hơn  85%  trường  hợp  mô  UTDTT  được  chẩn  đoán  bằng  hóa  mô  miễn  dịch  có  kết  quả  dương  tính  với  EGFR(11).  Đây  là  một  đích  rất  quan  trọng  trong  điều  trị  UTDTT.  Nghiên  cứu  cũng  cho  thấy  việc  điều  hòa  quá  trình  truyền  tín  hiệu  từ  thụ thể EGFR tới nhân bào có sự tham ra rất tính  cực  của  một  nhóm  protein  mang  hoạt  tính  GTPase mà nổi bật là Kras(5). Nghiên cứu dịch tễ  học  cho  thấy  có  khoảng  40‐45%  bệnh  nhân  UTDTT mang đột biến gen kras(3). Đồng thời các  thử nghiệm lâm sàng đã khẳng định cetuximab  và  panitumumab  (những  thuốc  được  chỉ  định  đ ...