Nhập môn công nghệ sinh học - Chương 3

Chương 3. Các kỹ thuật của công nghệ gen - Sự khác nhau căn bản của kỹ thuật mới với phương pháp cũ ở chỗ cho phép trong điều kiện thí nghiệm in vitro (trong ống nghiệm) tạo thành (ghép nối) các tổ hợp có hoạt tính khi đưa trở vào tế bào sống từ các đoạn DNA khác nhau có lựa chọn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nhập môn công nghệ sinh học - Chương 3CHÖÔNG IIICAÙC KYÕ THUAÄT CUÛA COÂNGNGHEÄ GENI- SÔ ÑOÀ KHAÙI QUAÙTII- CAÙC COÂNG CUÏIII- CAÙC KYÕ THUAÄT VAØ PHÖÔNGPHAÙP CAÊN BAÛNIV- PHÖÔNG PHAÙP PCRV. XAÙC ÑÒNH TRÌNH TÖÏ CAÙCNUCLEOTIDE CUÛA GEN• Vaøo naêm 1972 – 1973, Berg, Boyer vaø Cohen ôû Mó ñaõ taïo neân phaân töû DNA taùi toå hôïp in vitro töø ba nguoàn vaät lieäu di truyeàn khaùc nhau. Tieáp theo, 1973 – 1974, nhoùm Cohen, Helinski, Boyer ñaõ laàn ñaàu tieân nhaän ñöôïc DNA taùi toå hôïp coù hoaït tính sinh hoïc. Söï khaùc nhau caên baûn cuûa kó thuaät môùi vôùi phöông phaùp cuõ ôû choã cho pheùp trong ñieàu kieän thí nghieäm in vitro (trong oáng nghieäm) taïo thaønh (gheùp noái) caùc toå hôïp coù hoaït tính khi ñöa trôû vaøo teá baøo soáng töø caùc ñoaïn DNA khaùc nhau coù löïa choïn.KÓ THUAÄT TAÙÙI TOÅ HÔÏP DNA. 1. Sô ñoâà khaùùi quaùùt.1.Taùch DNA plasmid vaø DNA teá baøo cho (ngöôøi). 2. Caét caû hai loaïi DNA restriction endonuclesae taïo caùc ñaàu so le coá keát. 3. Troän 2 loaïi DNA ñeå gaén gen laï vaøo plasmid. 4. Ligase taïo lieân keát hoùa trò (Phosphodiester) . 5. Chuyeån ADN taùi toå hôïp vaøo teá baøo nhaän (vi khuaån E.coli). 6. Taïo doøng. II. CAÙC COÂNG CUÏ• 1. CAÙC COÂNG CUÏ ENZYME. – Restriction endonuclease (caét). – Ligase (noái). – Reverse transcriptase. – DNA-polymerase – Nuclease. – Taq-polymerase. RESTRICTION ENDONUCLEASE (RE)•- Phaân laäp töø vi khuaån, maø 25% coùít nhaát 1 RE.- Trình töï nhaän bieát (recognitionsite) treân DNA maïch keùp. Ví duïe.g. EcoRI: --- GAATTC--- --- CTTAAC---- Coù 3.000 RE ñaõ ñöôïc phaùt hieään vôùihôn 230 trình töï nhaään bieát Wadsworth Wadsworth CenterORNL b. Enzyme Ligase (noái).•Lieân keát phosphodiester ñöôïc taïo ra giöõa G-A hay A-G treân moãi maïch DNA . c) Enzyme phieân maõ ngöôïc (Reversetranscriptase)• Enzyme reverse transcriptase coù khaû naêng toång hôïp neân DNA moät maïch ñöôïc goïi laø c-DNA (complementary DNA) töø khuoân mRNA hoaëc töø moät ñoaïn polyribonucleotide toång hôïp hoaù hoïc. Nhôø enzyme reverse transcriptase naøy coù theå toång hôïp haàu nhö baát cöù gen rieâng bieät naøo mieãn coù maët mRNA cuûa gen ñoù. Caùc c-DNA maïch ñôn coù theå ñöôïc bieán thaønh maïch keùp nhôø DNA polymerase vaø ñöôïc goïi laø c-DNA keùp (c-DNA duplex) .• Ñoaïn c-DNA keùp ñöôïc gaén vaøo plasmid vaø bieán naïp vaøo vi khuaån ñeå taïo doøng c-DNA. d) Caùc enzyme khaùcEnzyme Chöùc naêngDnase I Phaân huyû DNA maïch keùp baèng thuyû giaûi noäi lieân keát phosphodiester.Nuclease BAL31 Phaân huyû caû 2 ñaàu muùt 3’ vaø 5’ cuûa DNA khoâng caét noäi lieân keát.S1 nuclease Phaân huyû DNA maïch ñôn.Ñoaïn Klenow DNA polymerase chæ coøn hoaït tính exonuclease 3’ –> 5’Taq DNA DNA polymerase chòu nhieät töø vipolymerase khuaån Thermophilus aquatus 2. CAÙC VECTOR CHUYEÅN GEN - Vector plasmid• - Phage lamda• - Cosmid• - YAC (Yeast artificial chromosome –NST• nhaân taïo cuûa naám men)• - Ti-plasmid töø vi khuaån Agrobacterium tumefaciens• - Phage 1 mach M13.MCR : MULTICLONING REGION Caùc vector chuyeån gen phaûi thoaû maõn caùc yeâu caàu toái thieåu :• – Coù caùc trình töï khôûi söï sao cheùp (ori) ñeå töï sao cheùp maø toàn taïi ñoäc laäp.• – Coù caùc trình töï nhaän bieát, nôi caét ñeå hôû laøm choã raùp ñoaïn gen laï vaøo.• – Caùc trình töï ñieàu hoøa (promoter) taïo thuaän lôïi cho söï phieân maõ gen laï.• – Ñaûm baûo söï di truyeàn beàn vöõng cuûa DNA taùi toå hôïp.• – Coù caùc gen ñaùnh daáu ñeå deã daøng phaùt hieän ra chuùng hoaëc caùc gen laï.Caùc vector chuyeån gen coù 5 öùng duïngquan troïng chuû yeáu :• – Taïo doøng vaø khueách ñaïi trình töï cuûa DNA (nhieàu baûn sao gioáng nhau).• – Nghieân cöùu söï bieåu hieän cuûa moät ñoaïn trình töï DNA.• – Chuyeån gen vaøo teá baøo caùc sinh vaät khaùc.• – Saûn xuaát RNA.• – Saûn xuaát protein töø gen ñöôïc taïo doøng.a) Caùc vector plasmid• Moät trong nhöõng plasmid ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát laø pBR322 (hình 3.4). Nhö moâ taû, plasmid naøy coù gen khaùng ampicilline (ampR), gen khaùng tetracyline (tetR), trình töï xuaát phaùt sao cheùp (ori) vaø nhieàu trình töï nhaän bieát ñaëc hieäu cho caùc RE nhö EcoRI , HindIII, BamHI, SalI,... Noù coù khaû naêng sao cheùp ñoäc laäp vôùi boä gen teá baøo E.coli vaø toàn taïi vôùi soá löôïng trung bình 20 – 30 baûn sao cho moãi teá baøo. ...