PCR lý thuyết

Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation) 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science” Đạt Nobel Prize hóa học 1993 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
PCR lý thuyết PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy MỤC TIÊU BÀI GIẢNG1. Trình bày được nguyên tắc PCR2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm trong PCR3. Trình bày được ứng dụng của PCR PCR POLYMERASE CHAIN REACTION Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation) 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science” Đạt Nobel Prize hóa học 1993 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao. PCRPOLYMERASE CHAIN REACTION PCRNGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG Amplicon 35-40 chu kì nhiệt Số copies = 2n.y n: Số cycle y: số copies ban đầu PCR POLYMERASE CHAIN REACTION 100 Denaturation 90 Biến tính 80 92-96oC Extension Lập lại ≥ 30 lầnTemperature (° C) 70 (chu kỳ) 60 Kéo dài 72oC 50 40 Annealing 30 Bắt cặp 45-55oC 20 10 1 2 3 4 5 6 Time (minutes) GĐ BIẾN TÍNH (92-96oC) 5’ 3’DNA đích 3’ 5’ 95oC 5’ 3’ 3’ 5’ GĐ BẮT CẶP (45-55oC) A B ~55oC Primers5’ 3’ B 5’ 5’ A3’ 5’ GĐ KÉO DÀI (72oC) 72oC 5’ 3’ Taq polymerase 5’ 5’ 3’ 5’ 72oC5’ 3’ 5’ 5’3’ 5’ Cycle 1 MỘT CHU KỲ NHIỆTGiai đoạn biến tính (92-96oC)Giai đoạn bắt cặp (45-55oC)Giai đoạn kéo dài (72oC) PCRPOLYMERASE CHAIN REACTIONĐỘNG HỌC CỦA PCR THÀNH PHẦN TRONG PCR 5’ 3’DNA đích 3’ 5’ A B Nucleotide tự do primers Mg2+ Mg 2+ Dd đệm chứa Mg2+ Taq DNA Mg 2+ Mg2+ magnesium Mg 2+ polymerase NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR1. DNA đích (đoạn DNA quan tâm) Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…, tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung…), [C] ≤ 1 µg (0,1-1 µg) Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường Tm=11x2+9x4=58oC5’ATTCCGATCGCTAATCGATG3’5’ATTCCGATCGCTAATCGATGGCTCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG3’3’TAAGGCTAGCGATTAGCTACCGAGGACACGTAAAGCGGTGATCTC5’ 3’CACGTAAAGCGGTGATCTC5’ Tm=9x2+10x4=58oC NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR3. DNA polymerase:enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹthuật đơn giản, đặc hiệu. [C]: 1-2.5 units Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích - Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt: Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermusthermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)… - Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp như Ampli Taq, Vent (exo). - Tổng hợp men polymerasechịu nhiệt có hoạt tính sửa sai(proofreading) khi tổng hợp chuỗinucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu. NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR4. dNTP (deoxy ribonucleotid): dATP, dGTP, dCTP, dTTP [C]: 20-200µM5. Ion Mg++ - cofactor của enzyme MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM)6. Dung dịch đệm pH 8.3-8.8 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR1. Máy luân nhiệt (THERMOCYCLER) (I) Thổi liên tục nhữngluồng khí nóng sinh ra từmột đèn phát nhiệt vàobuồng ủ, hay luồng khílạnh sinh ra từ một dànlạnh của máy làm lạnh (LightCycler – Roche). THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR(II) Dựa theo hiệu ứng Peltier ngược.Hai thanh kim loại nối vớihai cực của nguồn điện vàđược điều chỉnh tự độngđể chiều dòng điện đi quacó thể thay đổi: bên nàynóng, bên kia lạnh. Khithay đổi chiều dòng điện thìnhiệt độ của hai thanhcũng thay đổi ngược lại:bên này lạnh, bên kia nóng ...