Phân lập và đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn bacillus licheniformis KG7 ưa nhiệt tại nguồn nước nóng kênh gà Ninh Bình

Việt Nam là nước có nguồn suối nước nóng rất phong phú nhưng việc khai thác các nguồn lợi từ vi sinh vật trong đó còn rất ít được quan tâm. Suối nước nóng Kênh Gà, huyện Gia Viễn,Ninh Bình đã được nghiên cứu khai thác từ lâu, nhưng nhiệt độ và tính chất của nguồn nước đãbị thay đổi theo thời gian. Vì vậy cần thiết phải kịp thời nghiên cứu và khai thác hiệu quả những tác dụng trị liệu của nguồn nước, đặc biệt là nguồn tài nguyên vi sinh vật ưa nhiệt tại đây nhằm hướng tới các ứng dụng công nghiệp.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập và đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn bacillus licheniformis KG7 ưa nhiệt tại nguồn nước nóng kênh gà Ninh BìnhHỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VIKHUẨN Bacillus licheniformis KG7 ƢA NHIỆT TẠI NGUỒN NƢỚC NÓNGKÊNH GÀ NINH BÌNHNGUYỄN QUỐC TRUNGHọc viện Nông nghiệp Việt NamNGÔ THỊ HIỀNChi c c Qu n lý chấng nông lâm th y s n Thanh HóaEnzyme là m t s n phẩm quan trọng từ sinh vật mà chúng ta có th, c biệt là từố ư ng vi sinh vật. V i ho t lư t tr i so v i các chơ, zcsi nh ng thành t u to l n cho nhi ĩư:ghiệp, nông nghiệp, y học,b o vệườệc khai thác và s dzư c r t nhiư c trên thếgiHăường enzyme trong công nghiệp trên thế git trên 3,3 tỉ USDăưt 4,4 tỉ USD trong 2015 (BBC research, 2011).Tuy nhiên v i b n ch t là protein enzyme r t dễ b biến tính bởi nhu kiện ccủườc biệt là bởi nhiệHơa hầu hết các quá trình s n xuu cần thiếtdiễn ra ở nhiệăệu su t ph n ứng, tiết kiệm nhiên liệu s n xuVì ậy việcnghiên cứu và khai thác các enzyme b n nhiệt là m t yêu cầu bứưt ra. Trong,ẩ ưệ ường sống ởường có nhiệườư: ốiư c nóng, núi l a, núi rồn tài nguyên sinh vật quan trọng s d ng trong s n xu tcác enzyme b n nhiệt.Việ Nư c có nguồn suố ư c nóng rưệc khai thác các nguồnl i từ vi sinh vậư c quan tâm. Suố ư c nóng Kênh Gà, huyện Gia Viễn,Nìư c nghiên cứu khai thác từ , ưệvà tính ch t của nguồ ưbổi theo thời gian. Vì vậy cần thiết ph i k p thời nghiên cứu và khai thác hiệu qu nh ngtác d ng tr liệu của nguồ ư , c biệt là nguồn tài nguyên vi sinh vậ ưệt tmư ng t i các ứng d ng công nghiệp.I. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUtừVật liệu: Mẫếư c l y từ nguồn khoáng nóng Kênh Gà – Ninh Bình. Thời gian tiến hành:ăPhương pháp nghiên cứuPhân lập vi khuẩhiệt: Mẫ ưư ccường th ch LB l ng (trong1 lít: Trypton 1g, Yeast extract 0.5g, NaCl 1g, bổ sung Agar và dẫ ưến 1L), ở nhiệ50oC. Theo dõi hình thái khuẩn l c, tế bào, Gram +/-, kh ăphân lập các chủngkhác nhau. L a chọn các chủng có khuẩn l c rõ, kh ăưởng, phát tri n m nh ởukiện nhiệcaoChẩn lo i phân tử vùng DNA-16S: Tách chiết DNA từ d ch nhân nuôi vi khuẩn (trong môiường LB, lắc sau 24h) theo quy trình của Ferris (1996) có bổKệm chiếtphá thành tế bào của vi khuẩn b n nhiệ (PT N ĩ ,) Nhân b n gen DNA 16S b ngph n ứng PCR v i c p mồ RIF ( ‟- gag ttt gat ccc ggc tca g- ‟) RIR ( ‟- gtc acc ttgotta cga ctt - ‟)ỳ nhiệt (95oC- ‟,ỳ: 94o- ”, o- ”, o- ”- ‟) S nphẩ P R ư c ki m tra trên gel agarose 1% và tinh s ch b ng kit QIAquick (Qiagen). Sd ng s n phẩ P Rch làm khuôn trong PCR v i từng mồ ơ RIF RIR1768HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6DTCS Quick Start Master Mix (Beckman coulter) vNTPu huỳnh quang. Chếoonhiệt: 1 chu kỳ: 96o- ”- ”- ‟ S n phẩ P R ư c tinh s ch m t lần n a b ng kitQIAọc b ng máy CEQ8000 (Beckman Coulter, Mỹ). Trình tNAnhRNA S ưọc c 2 chi u và lắp ghép l i. So sánh trình t trên genebank s d ng công cBLAST N 2.2.31, NCBI.Xáịnhh h ởng c a các yếu tốing: Ản ưởng của pH: chủng vi khuẩ ư cường LB l ng lắc ở 50oC, 150 vòng/phút trong 24h v i 12 mức pH (5,5 - 6,0 6,5 - 7,0 - 7,5 - 8,0 – 8,5 – 9,0 – 9,5 – 10,0). Sau mỗi 2h tiếậvi khuẩn b ng máyổ ở ư c sóng 600 nm. Số liệ ư c s dxây dườưởngnh pH tố ưủng vi khuẩ Xnhưởng của nhiệ: Chủng vi khuẩnư c l a chọ ưường LB l ng lắc ở pH tố ư ,v i 7 mức nhiệt(40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC). Sau mỗi 2h tiếậvi khuẩnbổ ở ư c sóng 600 nm. Số liệ ư c s dxây dường congưởnh nhiệtố ưủng vi khuẩnThử kh ă g i h e z e g i bào: D ch nuôi c y vi khuẩn ởu kiện tố ưư c ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và tiếnh ho t tính enzyme amylase,protease và cellulase bươếĩXnhưởng củanhiệt i ho t tính của enzyme ngoươAi tiến (Yang và Wang,1994) s dHdừng ph n ứng.II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU1. Kết quả phân lậpSau khi phân lậường LB rắ ,ơbư c 8 chủng vi khuẩn (KG1, KG2, KG3, KG4,KG5, KG , KGKG )ưởng m nh ởu kiện50oC. Các chủưưầu v hìnhthái, kh ătc ưnh là lo iGươĐ tiến hành các thí nghiệukiện nuôi c y tố ưt tính các enzyme ngo i bào,chúng tôi l a chọn chủng KG7 có tốưởng m nhnhnh danh d a trên trình tn gen mã hóa rRNA16S Đm hình thái chủng KG7: khuẩn l c màu trắng,trong, tròn, nhẵn và có vác trên b m t. Tế bào Gramươ , ìue và có kh ăng m nh.2. Kết quả định danh chủng KG7DNA của chủ KG ư c tách chiết b ng quy trìnhFerris, 1996 c i tiến khi tế bào vi khuẩn không b phá vỡ ởu kiện nhiệ,khắc ph c enzyme protease Kb n nhiệ ư c bổệm chiết. DNA tổng số củachủ KG ư c ki m tra trên gel Agarose 1% cho ch tư ng tố , ăNA, é,ứt gãy (hình 2).Mẫu DNA chủ KG ư c s dnhân dòngn gen RNA 16S gi a 2 c p mồi RIB16 F&R. S n phẩ P R ư c ki m tra bện diư cdng 770 bp. S n phẩm PCR tinh s ch tiếọc tr c tiếp trênmáy CEQ8000 theo 2 chi(RIF)ư (RIR)é ì. Kết qu1769HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6trình t so sánh v i chủng Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580 thu ưư Hìvà Hình 4 cho th y chủng KG7 thu c chi Bacillus, tt tên là Bacillus licheniformis KG7.Đẩn có tiă ứng d ng to l n trong công nghiệp v i kh ăzngo i bào rng: proteases, pectate lyases, lipases and nhi u lo i enzyme phân hủypolysaccharide (Veith, 2004). Toàn b genome củư c gi i trình t v i tên chủngBacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580 (Genbank, NCBI).Hình 3: So sánh trình tự của chủng KG7 với chủng Bacillus licheniformisDSM 13=ATCC 14580 trên Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov)Hình 4: Cây phân loại chủng KG7 xây dựng bằng phần mềm BLASTN 2.2.31(www.ncbi.nlm.nih.gov) (NQTrung, 2009)3. Kết quả ác định ảnh hưởng của nhiệ độ, pH tối ưChủ KGưởngường LB l ng, lắc m nh nh t ở pH 7,5-8,0, các mứcopH 8,u ức chếưởng của vi khuẩn (Hình 5). Nhiệtố ư,nhiệtối thích cho loài Bacillus licheniformis nói chung (Veith, 2004). Chủ KG ư c1770 ...