Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng ralstonia solanacaerum gây bệnh héo xanh lạc và vừng

Trong phạm vi bài báo này, các tác giả sẽ đưa ra một số kết quả phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh lạc và vừng để sản xuất các chế phẩm vi sinh đối kháng ứng dụng trong sản xuất lạc và vừng ở Việt Nam.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng ralstonia solanacaerum gây bệnh héo xanh lạc và vừng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tập 48, số 3, 2010 Tr. 33-42 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG Ralstonia solanacaerum GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ VỪNG LÊ NHƯ KIỂU, TRẦN QUANG MINH, LÊ THỊ THANH THỦY, NGUYỄN VĂN HUÂN 1. MỞ ĐẦU Hiện nay lạc và vừng được trồng rất phổ biến ở các nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, đây là hai loại cây công nghiệp ngắn ngày nhưng cho hiệu quả kinh tế cao trên một đơn vị diện tích, đặc biệt cây vừng có thể trồng ở những vùng đất cằn cỗi, khô hạn. Song thực tế sản xuất 2 loại cây trồng này gặp rất nhiều khó khăn, trong đó bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là một trở ngại lớn nhất. Ở nước ta bệnh héo xanh do vi khuẩn đã phát sinh ở hầu hết các địa phương có trồng vừng và lạc như: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Nghệ An.... có nơi, có lúc bệnh đã gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 100% cây trồng. Mặc dù người nông dân đã áp dụng nhiều biện pháp phòng trừ bệnh, kể cả sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học nhưng hiệu quả thu được không như mong muốn, trái lại còn gây ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái, sức khỏe cộng đồng [6]. Đáng ngại hơn là sự tùy tiện về liều lượng cũng như thời gian phun thuốc đã để lại một lượng thuốc khá cao trong các sản phẩm nông nghiệp và gây ra những vụ ngộ độc ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người. Thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học ra đời đã khắc phục được những nhược điểm vốn có của thuốc bảo vệ thực vật hóa học và tăng cường bảo vệ môi trường. Trong đó hướng sử dụng các nhóm vi sinh vật có khả năng đối kháng với các tác nhân gây bệnh cho thực vật đã được quan tâm đặc biệt ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam [2]. Trong phạm vi bài báo này, các tác giả sẽ đưa ra một số kết quả phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh lạc và vừng để sản xuất các chế phẩm vi sinh đối kháng ứng dụng trong sản xuất lạc và vừng ở Việt Nam. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Hai chủng vi khuẩn R. solanacearum (TS3 và SV2) nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh và có nguồn gốc phân lập từ cây lạc, vừng bị bệnh thu thập từ hai huyện Nghi Lộc và Yên Thành tỉnh Nghệ An. Các chủng vi khuẩn đối kháng R. solanacearum phân lập từ đất trồng lạc, vừng. Các loại cây lạc, vừng đang trồng phổ biến ở miền Bắc. Môi truờng KingB (Yeast extract 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml), TTC (pepton 10 g; cazein hydrolyzat 1 g; glucoza 5 g; thạch 20 g; nước cất 1 lần 1000 ml. Khử trùng ở 0,5 ở 121°C, 20 phút, làm lạnh đến 60°C và thêm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1%). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 33 Phương pháp phân lập vi khuẩn đối kháng tiến hành theo Geels và Schippers -1983. 10 g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để lắng tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng. Mẫu thu từ các cây được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng phần dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng. Bước 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhất định, sao cho khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ 28oC ÷ 30oC trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt. Bước 2: Những khuẩn lạc có sắc tố vàng, nâu hoặc xanh nhạt được hoà loãng trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 100µl dung dịch trải đều trên bề mặt đĩa môi trường KB hoặc PDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi ủ ở 28oC ÷ 30oC trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt). Bước 3: Phun dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường, ủ ở nhiệt độ 28oC ÷ 30oC trong 24 ÷ 48 giờ. Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vòng vô khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó. Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước cất khử trùng hoặc glyxerol 30% ở - 80oC để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh: bằng cách đo đường kính vòng ức chế; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (đối với trường hợp cấy điểm) hoặc lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch), nơi mà vi sinh vật gây bệnh không sinh trưởng được [5]. Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn đối kháng đối với chuột bạch: theo phương pháp LD50 oral (liều gây chết trung bình 50% cá thể chuột khi thuốc xâm nhập qua đường miệng) của NIAST, 2003. Chuột bạch có trọng lượng 18 g/con được nuôi ổn định trong 3 ngày, sau đó phân thành các công thức tương ứng với số lượng chủng vi khuẩn đối kháng thí nghiệm và chủng B.subtilis trong men tiêu hóa làm đối chứng dương, mỗi chủng vi khuẩn kiểm định được tiến hành trên 15 con và chia thành 3 lô, mỗi lô được bố trí ăn thức ăn đã được trộn với dịch vi khuẩn đối kháng tương ứng với các nồng độ ...