Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR

Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X, gây ra bởi đột biến gen F8, dẫn đến tình trạng thiếu hụt yếu tố đông máu (FVIII) ở nhiều mức độ. T Bài viết trình bày việc tối ưu quy trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 494 - THÁNG 9 - SỐ 1 - 202040% các bệnh nhân bị glôcôm đã sử dụng thuốc 2. Đinh Thu Trang (2015), Phân tích hoạt độngtrên 4 tuần, tỉ lệ này cao hơn gấp đôi nhóm bệnh của các nhà thuốc đạt tiêu chuẩn thực hành tốt nhà thuốc GPP trên địa bàn thành phố Thủ Dầunhân không bị glôcôm (p vietnam medical journal n01 - SEPTEMBER - 2020 Background: Hemophilia A is an X-linked, trong nhóm bệnh hemophilia A thể nặng làrecessively inherited bleeding disorder, caused by tương đối cao (20-30%) [3].mutations of the F8 gene that leads to a deficiency ofcoagulation factor (FVIII) in many levels. Among Để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 cóthose, mutation intron 22 inversion is account for nhiều phương pháp được sử dụng như: Southernapproximately 40% of severe hemophilia A cases. To Blot, Inversion PCR (I-PCR) và Long - distanceprovide another tool for this mutation detection, our PCR (LD-PCR) [1] [4] [5] [6]. Tuy nhiên, cácresearch group at the National Institute of Hematology phương pháp trên đều có nhược điểm là thời- Blood Transfusion developed a new RT-PCR protocol gian thực hiện kéo dài và không ổn định. Trongbased on RNA samples. Aims: To optimize RT-PCRassay for detection of intron 22 inversion. Patients nghiên cứu của Debargh Dutta và cộng sựand Methods: The study was performed on 32 (2016), tác giả sử dụng kỹ thuật PCR phiên mãsamples of severe hemophilia A patient and 3 samples ngược kết hợp với kỹ thuật PCR lồng (RT-NPCR)of carrier at the National Institute of Hematology - nhằm khuếch đại 2 phản ứng độc lập. Đối vớiBlood Transfusion. Using RT-PCR technique, adapted người mang đột biến đảo đoạn intron 22, mRNAfrom Debargh Dutta et al (2016), perform twoamplification reactions simultaneously, including: có cấu trúc bị đứt gãy từ exon 22 và một phầnreaction 1 for amplifying fragment from exon 22 to còn lại của intron 22[7]. Vì vậy, thiết kế mồi đặcexon 23; reaction 2 for amplifying fragment from exon hiệu khuếch đại từ exon 19 đến stop codon của19 to the first in-frame stop codon within intron 22. intron 22 nhằm phát hiện được người mang độtResults: The optimal condition of RT-PCR is: 50oC/30 biến đảo đoạn intron 22. Bên cạnh đó, một phảnminutes; 95oC/2 minutes, [94oC/15 seconds, 60oC/45 ứng độc lập khác được thiết kế khuếch đại từseconds, 68oC/60 seconds] x 40 cycles, 68oC/5minutes. The limit of detection is 10-200 ng/µl, which exon 22 đến exon 23 có vai trò là một phản ứngcorresponds to 30-600 ng RNA. RT-PCR technique kiểm chứng, luôn cho sản phẩm ở người có allendetected 6 patients with intron 22 inversion, 3 bình thường. Nghiên cứu đã xây dựng được quycarriers, 26 samples without intron 22 inversion; trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằngexactly coincided with the Long-distance PCR kỹ thuật RT-NPCR, với kết quả thực hiện hoàntechnique. Conclusions: Optimized RT-PCR fordetection of intron 22 inversion. This method can be toàn trùng khớp với kỹ thuật I-PCR. [7] Phươngused as reliability and accuracy means in diagnosis of pháp này chính xác và đơn giản nhưng thời gianintron 22 inversion. thực hiện vẫn dài và dễ bị nhiễm chéo do thực hiện 2 vòng phản ứng. Để khắc phục nhượcI. ĐẶT VẤN ĐỀ điểm của kỹ thuật RT-NPCR, chúng tôi tiến hành Bệnh Hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là nghiên cứu với mục tiêu: Tối ưu hóa quy trìnhbệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X, dẫn đến giảm gây bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR.nồng độ hoạt tính yếu tố VIII trong máu. Gentổng hợp yếu tố VIII (F8) có kích thước 186 kb, II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUbao gồm 26 exon, nằm ở vị trí locus 28 thuộc Đối tượng nghiên cứu: 32 mẫu máu ngoạicánh dài trên nhiễm sắc thể X (Xq28) [2] [3]. vi của bệnh nhân hemophilia A thể nặng Có rất nhiều đột biến gen F8 đã được xác (FVIII TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 494 - THÁNG 9 - SỐ 1 - 2020(kích thước 225 bp trong phản ứng 1 và 378 bp mẫu người bệnh (HA) cho sản phẩm PCR có kíchtrong phản ứng 2) [7] thước 10 kb và 11 kb, người bình thường cho Kỹ thuật LD-PCR: Kỹ t ...