Phát hiện đột biến gen RB ở mức rna trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Nội dung bài viết giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u nguyên bào võng mạc. Phát hiện đột biến gen RB có ý nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen RB từ RNA của máu và mô u.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện đột biến gen RB ở mức rna trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN RB Ở MỨC RNA   TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC  Hoàng Anh Vũ*, Nguyễn Công Kiệt**  TÓM TẮT  Giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u nguyên bào võng mạc (UNBVM). Phát hiện đột biến gen RB có ý  nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng  như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị.  Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen RB từ RNA của máu và mô  u.  Đối tượng và phương pháp: Toàn bộ vùng mã hóa protein của gen RB gồm 27 exon đã được khuếch đại và  giải trình tự chuỗi DNA từ 4 bệnh nhân.  Kết quả: Chúng tôi phát hiện một bệnh nhân có đột biến mất đoạn exon 2, một bệnh nhân bị mất đoạn exon  14 và một bệnh nhân bị chèn thymine trên exon 3.  Kết  luận: Kỹ thuật xác định đột biến gen RB ở mức RNA có thể ứng dụng trong công tác chẩn đoán và  điều trị cho bệnh nhân.  Từ khóa: u nguyên bào võng mạc, đột biến gen RB, giải trình tự chuỗi DNA  ABSTRACT  DETECTION OF RB MUTATIONS AT RNA LEVEL IN RETINOBLASTOMA PATIENTS  Hoang Anh Vu, Nguyen Cong Kiet  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 72 ‐ 75  Introduction: Mutations in the RB gene cause retinoblastoma. Detection of RB mutations is important for  a strategy for cancer screening in carriers and for prediction of relapse in retinoblastoma patients.  Objective: This study  aims  to  establish  a  testing  procedure  for  RB  mutant  identification  from  blood  and  tumor‐derived RNA.  Patients and methods: The RB coding region encompassing 27 exons were amplified and sequenced from  4 patients.  Results:  We  found  RB  mutations  in  3  patients,  including  deletion  of  exon  2,  deletion  of  exon  14  and  insertion of thymine in exon 3.  Conclusion: The technique described here should be applied to clinical setting.  Key words: retinoblastoma, RB gene mutation, DNA sequencing  sinh  sống  và  không  có  sự  khác  biệt  giữa  các  ĐẶT VẤN ĐỀ  chủng tộc và giới tính(6). Bệnh thường biểu hiện  U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là dạng  trước 3 tuổi với các dấu hiệu đồng tử  trắng, lé,  ung  thư  hốc  mắt  thường  gặp  nhất  ở  trẻ  em,  thị lực kém, mắt đỏ và đau (khi có biến chứng).  chiếm khoảng 3% trong tổng số các trường hợp  Các  trường  hợp  UNBVM  có  tính  gia  đình  ung thư trong lứa tuổi này. Tần suất bệnh được  chiếm  40%,  thường  có  nhiều  u,  biểu  hiện  ở  cả  ước  tính  trong  khoảng  1/15.000  –  1/20.000  trẻ  hai mắt và xuất hiện triệu chứng sớm trong năm  *Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM  **Bộ môn Mắt, Đại học Y Dược TPHCM  Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ  Email: hoangvuxinh@yahoo.com Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  ĐT: 0122‐2993537 71 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 đầu  tiên(8).  Các  trường  hợp  ngẫu  nhiên  thường  chỉ  có  1  khối  u  của  1  bên  mắt  và  khởi  phát  trễ  hơn. Tại Việt Nam, hầu hết bệnh nhi thường chỉ  được  phát  hiện  ở  giai  đoạn  trễ,  xâm  lấn  nhiều,  đe  dọa  tính  mạng  nên  điều  trị  bảo  tồn  rất  hạn  chế  và  phải  cắt  bỏ  nhãn  cầu(8).  Trong  khi  đó,  ở  các nước phát triển, tỷ lệ điều trị thành công trên  95% do được phát hiện sớm(7).  Đột biến gen RB gây ra sự bất hoạt của cả 2  alen  đã  được  xác  định  là  nguyên  nhân  gây  UNBVM  trong  cả  các  trường  hợp  có  tính  gia  đình  và  ngẫu  nhiên(5).  Đột  biến  ở  alen  đầu  tiên  có thể là đột biến mầm ở các trường hợp có tính  gia đình hoặc đột biến sinh dưỡng trong trường  hợp  bệnh  ngẫu  nhiên;  trong  khi  đó  đột  biến  ở  alen thứ hai là đột biến sinh dưỡng xảy ra trên tế  bào của võng mạc. Việc phát hiện đột biến gen  RB trong UNBVM có ý nghĩa quan trọng trong  việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư  cho  người  lành  mang  gen  đột  biến  cũng  như  góp  phần  đánh  giá  nguy  cơ  tái  phát  trên  bệnh  nhân đang được điều trị(2,6).  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  4  bệnh  nhi  UNBVM  được  điều  trị  tại  Bệnh  viện  Mắt  TPHCM  thỏa  các  điều  kiện:  Bệnh  nhi  được chẩn đoán xác định UNBVM dựa vào kết  quả khám lâm sàng, chụp cắt lớp điện toán, siêu  âm và giải phẫu bệnh sau khi được cắt bỏ nhãn  cầu.  Cha  mẹ  của  mỗi  bệnh  nhi  có  giấy  đồng  thuận tự nguyện tham gia nghiên cứu này.   Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA  Từ  mỗi  bệnh  nhi,  chúng  tôi  thu  nhận  4  mL  máu ngoại vi được chống đông trong EDTA có  bổ  sung  puromycin  (200  μg/mL)  và  lắc  nhẹ  trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó RNA được  tách  chiết  bằng  RNeasy  mini  Kit  (Qiagen,  Mỹ)  theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo  nồng  độ  bằng  máy  quang  phổ  kế  spectrophotometer. DNA bổ sung (complement  DNA  hay  cDNA)  được  tổng  hợp  từ  1  μg  RNA  với  bộ  hóa  c ...