Phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne và becker bằng kỹ thuật MLPA

Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài đề cập về: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne và becker bằng kỹ thuật MLPAY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010Nghiên cứu Y họcPHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠDUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPANguyễn Khắc Hân Hoan*, Quách Thị Hoàng Oanh*, Phạm Ngọc Khôi**, Nguyễn Thị Phương Mai***,Ngô Diễm Ngọc***, Trần Vân Khánh****TÓM TẮTĐặt vấn đề: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65%trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn genrất hiệu quả.Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.Phương pháp: 18 mẫu DNA của bệnh nhân nam đã chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã pháthiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR. Được khảo sát 79 exon trên gen DMD bằng kit Salsa MLPAP034A2 và P035A2, điện di mao quản bằng CEQ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker.Kết quả: MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến,khảo sát được hết 79exon của gen DMD, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao. Mọi exon của gen DMDbị mất đều được khẳng định trên biểu đồ. Bộ 3 multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon và có những exon khôngđược phát hiện.Kết luận: Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưuđiểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR.Từ khóa: Bệnh loạn dưỡng cơ, Duchenne, Becker, bệnh di truyền, đột biến gen, exon, kỹ thuật PCR, kỹthuật MLPA.ABSTRACTMLPA IN DETECTION OF DELETION MUTATIONS CAUSING DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHYNguyen Khac Han Hoan, Quach Thi Hoang Oanh, Pham Ngoc Khoi, Nguyen Thi Phuong Mai,Ngo Diem Ngoc, Tran Van Khanh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 4 - 2010: 53 - 60Background: DMD and BMD are genetic disorders caused by DMD mutations. More than 65% of casesare deletion or duplication mutation. Recently, MLPA is described as an effective method to dectect thesemutations.Objective: Evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations.Method: 15 DNA samples of male affected with DMD/BMD detected with deletion mutations by multiplexPCR are tested for 79 exons with Salsa MLPA P034A2 và P035A2 kit, capillary electrophoresed with CEQ 8000and automated analysis with Gene Marker software.Results: MLPA allows to detect the size of DNA fragment lost, the technique is easy, visual, rapid andreproducible. All 79 deleted exons are present in electropherograms. Set of 3 multiplex PCR only detects 25 exonsand some exons cannot be found by this set.Conclusion: MLPA helps to rapid detection all deletions of DMD gene and is prominent to multiplex PCR.* Khoa Di truyền y học – Bệnh viện Từ Dũ, ** Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nông Lâm TPHCM,*** Khoa Di truyền Tế bào và Phân tử – Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học Y Hà nộiTác giả liên lạc: BS Quách Thị Hoàng Oanh,ĐT: 084-913833666,Email: oanhqch@yahoo.comHội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 20101Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010Nghiên cứu Y họcKey word: Muscular dystrophy, Duchenne, Becker, genetic disorder, mutation, exon, PCR, MLPA.với khả năng khuếch đại cùng lúc đến 45 vị tríĐẶT VẤN ĐỀDNA đích khác nhau trong một phản ứng(18,19).Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) vàMỗi probe MLPA gồm 2 đoạn oligonucleotidebệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh dilai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề vớitruyền thần kinh cơ phổ biến nhất, với xuất độnhau, dài 22-43 nucleotide và một PCR primerkhoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7). Bệnh do độtxuôi hoặc ngược giống nhau ở tất cả các probe.biến gen dystrophin (gen DMD) gây ra. Đây làĐể phân biệt sản phẩm khuyếch đại, các probegen lớn nhất ở người nằm dài 2400kb ở vị trícòn chứa một đoạn DNA gắn chèn không thamXp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1,8,15).gia vào lai có kích thước thay đổi (19–364 nt).Thông tin chi tiết về gen được phổ biến tạiSau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, 2www.dmd.nl.đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghépBệnh nhân DMD thường bị nhược cơ xuất(ligation) với nhau. Sản phẩm nối có cả primerhiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiến triển nhanh, mất khảxuôi và ngược và được khuếch đại bằng PCR. Sốnăng đi lại và chết ở lứa tuổi 20 do vì tổn thươnglượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệcơ tim và rối loạn hô hấp. Bệnh nhân BMD biểuvới số bản sao của trình tự đích trong mẫu khảohiện bệnh nhẹ hơn, tiến triển chậm và có cuộcsát. Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽsống kéo dài. Tuy nhiên chất lượng cuộc sốngđược nhận biết bằng hệ thống giải trình maothường kém(7).quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ đượcHơn 65% trường hợp bệnh DMD và BMDđịnh lượng(18,19).là do đột biến mất đoạn gen hoặc lập đoạn genKỹ thuật đã được ứng dụng vào chẩn đoándystrophin gây ra(2,10,17). Các loại đột biến khácđột biến ...