Phát hiện đột biến nhờ Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing)

.Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định cho được trình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc xác định trình tự của ADN cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năng của gene, mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện đột biến nhờ Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing) Phát hiện đột biến nhờ Xác địnhtrình tự của DNA (DNA sequencing)Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định cho đượctrình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc xác địnhtrình tự của ADN cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năngcủa gene, mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết. Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của ADN bằng cách sử dụng phương pháp dideoxyMột kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự của ADN là phươngpháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick Sanger đưa ra. Phương phápnày được thực hiện bằng cách sử dụng các dide- oxynucleotide chấm dứtchuỗi (chain-terminating dideoxynucleotide). Đây là các nucleotide có cấutrúc tương tự như các deoxyribonucleotide bình thường khác chỉ khác ở chỗchúng thiếu mất một nhóm hydroxyl trong cấu trúc. Sự khác biệt này trongcấu trúc làm cho phân tử này không thể tạo thêm liên kết phosphodiester vớicác nucleotide tự do. Như vậy mặc dù các dideoxynucleotide có thể gắn vàomột chuỗi ADN đang được tổng hợp nhưng sau nó không có thêm nucleotidenào gắn vào thêm được nữa và chấm dứt quá trình nhân đôi ngay tại vị trí đó.Người ta sử dụng 4 loại dideoxynucleotide khác nhau, mỗi loại sẽ bổ sungvới các deoxyribonucleotide A, T, G, hoặc C.Trình tự của một chuỗi đơn ADN nào cần đọc trình tự sẽ đựơc trộn với cácprimer được đánh dấu bằng các chất hoạt tính phóng xạ, ADN polymerase,các nucleotide thông thường và một loại dideoxynucleotide. Primer sẽ lai vớimột vị trí tương ứng trên chuỗi đơn ADN theo nguyên tắc bổ sung và ADNpolymerase sẽ giúp bổ sung tiếp các nucleotide như trong kỹ thuật PCR.Dideoxynucleotide sẽ gắn vào chuỗi ADN đang được tổng hợp khi cónucleotide tương ứng theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên khi điều này xảy rathì quá trình tổng hợp chuỗi ADN cũng bị ngừng lại.Ở bất kỳ một vị trí nhất định nào, hoặc sẽ có một nucleotide bình thườnghoặc một dideoxynucleotide có thể được thêm vào một cách ngẫu nhiên. Quátrình này cho phép tạo nên các đoạn ADN với chiều dài khác nhau, mỗi đoạnđều kết thúc bời cùng một loại dideoxynucleotide. Những đoạn ADN có thểphân lập theo chiều dài bằng điện di như trình bày ở phần trên.Bốn loại phản ứng khác nhau được thực hiện cho 4 loại nucleotide, các đoạnthu được từ mỗi loại phản ứng sẽ được chạy điện di bên cạnh nhau trên cùngmột gel để vị trí của các đoạn có thể so sánh được với nhau. Vì mỗi band ứngvới một chuỗi ADN tận cùng bởi 1 loại base duy nhất nên trình tự của ADNcó thể được đọc bằng cách quan sát thự tự của các band trên gel sau khi sửdụng kỹ thuật phóng xạ tự chụp (các primer có hoạt tính phóng xạ sẽ chỉ vị trícủa các đoạn ADN trên phim). Trong mỗi quá trình phản ứng như vậy có thểđọc được trình tự của vài trăm cặp base.Tuy nhiên cách đọc trình tự của ADN theo cách này tương đối chậm, khókhăn và dễ sai sót. Gần đây kỹ thuật đọc trình tự ADN tự động (automatedADN sequenced) sử dụng hệ thống phát hiện màu huỳnh quang (fluorescent),hóa chất phát sáng (chemiluminescent) hoặc hệ thống đo màu (colorimetric)đang được phát triển. Việc sử dụng các primer hoặc dideoxynucleotide đượcgắn huỳnh quang giúp cho phương pháp này trở nên phổ biến.Một mạch khuôn ADN được đọc trình tự bằng cách sử dụng phương pháptương tự bước kéo dài primer trong kỹ thuật PCR. Mỗi một trong 4dideoxynucleotide khác nhau được gắn với một loại màu huỳnh quangcho phép phát ra một phổ ánh sáng riêng. Các đoạn ADN đã được gắn huỳnhquang sau phản ứng tổng hợp sẽ được điện di trên gel polyacrylamide rấtmỏng rồi sau đó được kích thích bằng một chùm tia laser . Ánh sáng phát rađược ghi nhận qua một camera kỹ thuật số (digital camera) để chuyển thànhcác tín hiệu điện tử và chuyển thành ảnh. Ảnh này được phân tích để chuyểnthành dạng đồ thị trong đó mỗi một loại nucleotide khác nhau được mô tảbằng một đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu này trên đồ thị chophép đọc trình tự của đoạn ADN. Một đoạn khoảng 500 bp của 64 ngườikhác nhau có thể được phân tích trên cùng một gel trong vòng từ 2 đến 4 giờ.Phương pháp đọc trình tự tự động cũng được thực hiện cho việc đánh giá tínhchất đa hình của các đoạn lặp ngắn (STRP), tính đa hình của đơn nucleotide(single-nucleotide polymorphism: SNP) và các dạng đa hình khác.Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu ADN được điện di trong cácống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary) chứ không phảitrên gel polyacrylamide. Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ratrong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra rất nhanh, kỹ thuậtnày cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ trong vòng 15 phút.Ngoài ra một kỹ thuật mới là sử dụng sắc ký khối phổ (mass spectroscopy),đây là một kỹ thuât có độ phân giải cao trước đây dùng để phân tích protein.Sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF (mat ...