Phát hiện nhiễm sắc thể philadelphia trên bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt bằng kỹ thuật PCR

Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát hiện và tiến hành phân tích gene tổ hợp BCR-ABL bao gồm BCR-ABL b2a2 và BCR-ABL b3a2 để xác định sựhiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML. Nghiên cứu tiến hành trên 60 bệnh nhân được xác định chẩn đoán là CML với tủy đồ dương tính và đang được điều trị trị ngoại trú tại Khoa Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 đến 19.11.2009
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện nhiễm sắc thể philadelphia trên bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt bằng kỹ thuật PCRY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010Nghiên cứu Y họcPHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂNUNG THƯ BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT BẰNG KỸ THUẬTPCRPhan Đình Điền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thái Sơn**TÓM TẮTĐặt vấn ñề và Mục tiêu nghiên cứu: Nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện trong máu ngoại biênvà tủy xương của bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia-CML)với tỷ lệ lớn hơn 95%, ñây là sản phẩm của sự chuyển ñoạn t(9;22), trong ñó ABL proto-oncogene từnhiễm sắc thể số 9 ñến gắn vào vị trí 5’ của gene BCR trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11).Với kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), ở ñây là RT-PCR chúng ta có thể phát hiện ñượcgene tổ hợp BCR-ABL của nhiễm sắc thể Philadelphia. Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát hiện và tiếnhành phân tích gene tổ hợp BCR-ABL bao gồm BCR-ABL b2a2 và BCR-ABL b3a2 ñể xác ñịnh sựhiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML.Đối tượng nghiên cứu: 60 bệnh nhân ñược xác ñịnh chẩn ñoán là CML với tủy ñồ dương tính vàñang ñược ñiều trị ngoại trú tại Khoa Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009.Phương pháp và mẫu nghiệm nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu cắtngang, mô tả. 04 ml máu ngoại biên của bệnh nhân sẽ ñược lấy và cho vào tube có chất chống ñôngbằng EDTA. Máu toàn phần sẽ ñược trích ly RNA, khuếch ñại 2 types của gene tổ hợp BCR-ABL làb2a2 và b3a2 bằng kỹ thuật RT-PCR, tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồngñộ chuẩn của gene β-glucuronidase (GUS) S1:100.000 copies/ml, S2: 10.000 copies/ml và S3:1.000copies/ml, ñược phát hiện real time cùng với mẫu nghiệm. Phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5Real-Time PCR System Software.Kết quả: Phát hiện ñược gene tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML với tỷlệ 98.33% (59/60 BN) trong ñó BCR-ABL b2a2: 32.20 %, BCR-ABL b3a2: 44.07 % và dạng kết hợpBCR-ABL b2a2 + b3a2 chiếm tỷ lệ 23.73 %.Kết luận: Những kết quả trên cho thấy có thể dùng kỹ thuật PCR ñể phát hiện nhiễm sắc thểPhiladelphia. Việc so sánh ñối chiếu kết quả này với các tác giả khác trong và ngoài nước cũng ñượcbàn luận ñể khẳng ñịnh giá trị của kỹ thuật.Từ khóa: Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, Gene tổ hợp BCR-ABL, Hoạt tính TyrosineKinase, Protein P210, Xét nghiệm RT-PCR.ABSTRACTDETECTION AND QUANTITATIVE THE PHILADELPHIA CHROMOSOME BY PCRTECHNIQUE IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA PATIENTSPhan Dinh Dien, Pham Hung Van, Nguyen Thai Son* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 - 2010: 565 - 569Background: The BCR-ABL fusion gene, formed by rearrangement of the breakpoint clusterregion (bcr) on chromosome 22 with the abl proto-oncogene on chromosome 9, is present in virtuallyall Chronic Myeloid Leukemia (CML) patients. The t(9;22) (q34;q11) translocation associated withBCR-ABL leads to a cytogenesis aberration known as Philadelphia chromosome, and it could bedetected by PCR technique.Objective: To detect and quantitative analysis for fusion genes BCR-ABL including BCR-ABLb2a2 and BCR-ABL b3a2 transcripts to confirm the presentation of Philadelphia chromosome inCML patients.*Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Chợ Rẫy ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí MinhTác giả liên hệ: TS Phạm Hùng Vân, ĐT: 0903698920, Email: phhvan.nkbiotek@gmail.comHội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010565Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010Nghiên cứu Y họcSubjects: 60 cases of CML patients in chronic phase (CP) were confirmed by positive bonemarrow smears that were undergoing treated in out patient department of Cho Ray hospital.Method and specimens: 04ml peripheral blood in an EDTA tube was collected, in thisquantitative assay; extracted RNA is subject to Real-Time Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction (RT-PCR) to amplify 02 types of BCR-ABL fusion transcripts: b2a2 and b3a2. An additionalamplification of the GUS gene (β-glucuronidase) is performed as a control for sample RNA qualityand as a reference for relative quantification.Results: Results show that the BCR-ABL fusion gene was found in 59 (98.33%) of these 60 bloodsamples. In these 59 positive cases, BCR-ABL b3a2 type has the highest rate of 44.07%, followed byBCR-ABL b2a2 type with 32.2%, and BCR-ABL b2a2 + b3a2 combinative type with 23,73%.Conclusion: These results indicate that PCR technique can be used to detect Philadelphiachromosome. We also compare our results with other local and foreign researchers to confirm theaccuracy of this technique.Keywords: Chronic Myeloid Leukemia, BCR-ABL, Tyrosine kinase, Protein P210, RT-PCR.ĐẶT VẤN ĐỀBệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) là một bệnh áctính của hệ tạo máu với ñặc ñiểm chính là sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt. Trong bệnh CML có một sựbiến ñổi nhiễm sắc thể ñặc trưng ñó là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph)(4), ñây là sản phẩm của sựchuyển ñoạn giữa nhiễm sắc thể số 9 và nhiễm sắc thể số 22 ký hiệu t(9;22)(5). Theo khảo sát của cácnhà nghiên cứu khoa học trên thế giới, nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện ở máu ngoại biên và tuỷxương của bệnh nhân CML là lớn hơn 95%(3,1).Nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy bản chất gene của nhiễm sắc thể Philadelphia làgene tổ hợp BCR-ABL(6) ñược tạo thành do sự chuyển ñoạn của ABL proto-oncogene từ nhiễm sắcthể số 9 ñến gắn vào vị trí 5’ của BCR gene trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11). Trong bệnhCML, gen tổ hợp BCR-ABL chủ yếu sẽ tạo ra một loại protein có hoạt tính Tyrosine Kinase ñó làprotein P210 (protein có trọng lượng phân tử 210 KD) và protein này chính là nguyên nhân chủ yếugây ra bệnh CML(7). Tùy theo vị trí sắp xếp các ñiểm gãy (breakpoints) khác nhau trên BCR-gene vàABL-gene ta có các sản phẩm BCR-ABL khác nhau: BCR-ABL b2a2 nếu vị trí sắp xếp các ñiểm gãynằm ...