Phát hiện và định lượng hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựng

Trong đề tài này nhằm nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định lượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện và định lượng hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựngNghiên cứu Y họcY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HEPATITIS B VIRUS DNABẰNG KỸ THUẬT REAL–TIME POLYMERASE CHAIN REACTIONVỚI ĐƯỜNG CHUẨN TỰ DỰNGNguyễn Trần Minh Thắng*, Trịnh Thùy Dương*, Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Như Hiền*TÓM TẮTĐặt vấn đề: HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh viêm gan cấp hoặc mãn. Người nhiễm virus viêmgan B mãn thường kết hợp với những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ đó gây ra cái chết của khoảng 500,000 –700,000 người mỗi năm. Vì vậy, kỹ thuật real-time PCR ra đời để định lượng HBV-DNA chính xác hơn, nhanhhơn, hiệu suất cao hơn và đã được áp dụng ở nhiều nơi trong cả nước.Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để địnhlượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B.Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả được tiến hành trên 46 bệnh nhân bị nhiễm virus viêm ganB. Tất cả bệnh nhân được định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng của bộmôn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐHYKPNT. Kết quả được so sánh với kết quả real-time PCR sửdụng đường chuẩn thương mại. Sự tương đồng giữa hai kỹ thuật được chứng minh qua test Wilcoxon, testSpearman và biểu đồ Bland và Altman.Kết quả nghiên cứu: Qua khảo sát, chúng tôi đã tối ưu hóa được điều kiện cho kỹ thuật real-time PCR vớinhiệt độ bắt cặp mồi 600C, nồng độ mồi 400 nM, nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM và độ nhạy của phản ứng là100 copies/ml. Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạtchuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. Từ đó, chúng tôi đã phát hiện và định lượngđược HBV-DNA ở 34 trong 46 trường hợp. So sánh với kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn thươngmại, kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn tự dựng cho thấy có sự tương đồng.Kết luận: Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượngHBV- DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT.Từ khóa: viêm gan, HBV-DNA, real-time PCR.ABSTRACTDETECTION AND QUANTITY Hepatitis B VIRUS DNA BY REAL-TIME Polymerase Chain ReactionWITH SELF-DEVELOPMENT STANDARDSNguyen Tran Minh Thang, Trinh Thuy Duong, Nguyen Kim Thach, Do Nhu Hien* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 182 - 189Introduction: HBV is a Hepadnavirus causing acute or chronic hepatitis. People infected with chronichepatitis B virus are often associated with many different clinical situations, thereby it has caused the death ofabout 500.000 to 700.000 patients every year. Thus, real-time PCR technique was born to quantify HBV-DNAmore accurately, more efficiently and faster and has been applied in many places in the country.Research Objective: the technical set up real-time PCR study with the self building standard curve toquantify HBV-DNA in the pre-S region 89bp in the patients blood sample tested for hepatitis B.*Bộ môn Sinh Hóa - Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc ThạchTác giả liên lạc: BS. Nguyễn Trần Minh Thắng182ĐT 0934.014.937Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011Nghiên cứu Y họcResearch Methodology: The descriptive study was conducted on 46 patients infected with hepatitis B. Allpatients were quantified HBV-DNA by real-time PCR technique with the self building standard curve ofBiochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine. Results werecompared with real-time PCR results using standard curve commercial. The similarities between the twotechniques will be demonstrated by Wilcoxon test, Spearman test and Bland and Altman graph.Research results: Through the survey, we have optimized the conditions for real-time PCR technique withprimer pairs temperature at 60C, 400 nM primer concentration, concentration of 100 nM Taqman sample probeand the sensitivity of reaction was 100 copies / ml. Testing the baseline was set up with R2 ≥ 0.99 and E% is100% and the angular coefficient is -3.58 with a standard primer pairs were selected specific for hepatitis B. Sincethen, we have detected and quantified HBV-DNA in 34 out of 46 cases. Compared with real-time PCR resultsusing standard curve commercial, real-time PCR results using self building standard curve shows thesimilarities.Conclusion: In this study, we have established real-time PCR technique using to quantify HBV-DNA withself building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University ofMedicine.Key words: hepatitis, HBV-DNA, real-time PCR.ĐẶT VẤN ĐỀNhiễm virus viêm gan B là một vấn đề đangrất được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giớihiện nay. Nhiễm virus viêm gan B là một trongnhững ...