Phát triển và đánh giá kỹ thuật real-time multiplex PCR xác định Burkholderia pseudomallei gây bệnh Melioidosis trong mẫu lâm sàng

Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phát triển kỹ thuật real-time multiplex PCR giúp xác định B. pseudomallei thông qua gen đích TTSS1-orf11 cùng với gen nội kiểm GAPDH để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, so sánh với PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển và đánh giá kỹ thuật real-time multiplex PCR xác định Burkholderia pseudomallei gây bệnh Melioidosis trong mẫu lâm sàng TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 495 - THÁNG 10 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 PHÁT TRIỂN VÀ ĐÁNH GIÁ KỸ THUẬT REAL-TIME MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI GÂY BỆNH MELIOIDOSIS TRONG MẪU LÂM SÀNG Bùi Thị Huyền1,2, Lương Thị Hoài Thương1,2, Hoàng Xuân Sử1, Hồ Anh Sơn1, Hoàng Văn Tổng1, Đinh Thị Thu Hằng1TÓM TẮT17 triển trong nghiên cứu này giúp xác định nhanh, Burkholderia pseudomallei là vi khuẩn Gram chính xác B. pseudomallei, góp phần nâng caoâm, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, là hiệu quả sàng lọc, điều trị bệnh melioidosis.nguyên nhân gây bệnh melioidosis cho người và Từ khóa: Burkholderia pseudomallei, chứngđộng vật, tỷ lệ tử vong đến 40%. Bệnh nội, melioidosis, TTSS1-orf11, real-timemelioidosis có các triệu chứng lâm sàng không multiplex PCR.đặc hiệu dẫn tới dễ chẩn đoán nhầm hoặc bỏ sót.Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu SUMMARYphát triển kỹ thuật real-time multiplex PCR giúp DEVELOPMENT AND EVALUATIONxác định B. pseudomallei thông qua gen đích OF A REAL-TIME MULTIPLEX PCRTTSS1-orf11 cùng với gen nội kiểm GAPDH để ASSAY FOR ACCURATE AND RAPIDđánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, so IDENTIFICATION OF MELIOIDOSISsánh với PCR. Phản ứng Taqman Probe AGENT BURKHOLDERIAmultiplex PCR tối ưu như sau: 0,2µM mồi PSEUDOMALLEI IN CLINICALqBp(F+R); 0,05µM, probe qBp-Pr; 0,2µM mồiIC(F+R), 0,05µM probe IC, nhiệt độ gắn mồi SPECIMENS60oC. Kỹ thuật real-time multiplex PCR đạt độ Burkholderia pseudomallei is a Gram-nhạy, độ đặc hiệu 100% khi đánh giá trên các negative bacterium that is necrotic in themẫu đối chứng B. pseudomallei, P. aeruginosa, environment but causes dangerous melioidosisB. cepacia, ngưỡng phát hiện 14,6 copy/ phản in humans and animals, with a mortality rate ofứng, độ chính xác cao (CV CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỶ NIỆM 60 NĂM TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA VINH HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂNthat the 95% detection limit was 14.6 copies per giới, trong lịch sử B. pseudomallei được coireaction, highly accuracy (CV TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 495 - THÁNG 10 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020(Glyceraldehyde-3-phosphate (Promega, Mỹ); primer Bp(F+R) 0,2 µM, 5dehydrogenase) một house-keeping gen với µl DNA và bổ sung nước khử ion vừa đủ thểcác chức năng trong đường phân, có sự ổn tích 20 µl. Phản ứng khuếch đại được thựcđịnh cao giữa các mô trong cơ thể người là hiện với chu trình nhiệt: (95oC/ 4 phút)chứng nội kiểm. (95oC/ 30 giây; 56oC/ 30 giây; 72oC/ 40 giây)x 30 chu kỳ (72oC/ 5 phút). Sản phẩmI. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Chủng vi khuẩn: Hai mươi hai chủng B. agarose 1,2%, nhuộm sản phẩm bằngpseudomallei, chủng đối chứng âm Ethidium bromide trong đệm TBE 0,5X.Burkholderia cepacia (B. cepacia), Tách dòng tạo chứng dương plasmidPseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) tái tổ hợp: Sản phẩm PCR của mẫu Bp1 sauphân lập từ mẫu máu, đờm, vết thương bệnh khi điện di kiểm tra có kích thước đúng nhưnhân được cung cấp bởi Bệnh viện Quân y tính toán lý thuyết (723 bp) được tinh sạch,103, Học viện Quân y và Bệnh viện Trung tạo dòng trong vector pGEM-T easyương Quân đội 108. Các chủng vi khuẩn này (Promega, Mỹ), biến nạp vào tế bào E. coliđược ký hiệu theo mã nghiên cứu từ Bp1 - DH5α. Plasmid tái tổ hợp được tinh sạch,Bp22, Bc1-Bc5 và Pa1-Pa5 tương ứng cho kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI vàB. pseudomallei, B. cepacia, P. aeruginosa. giải trình tự, nồng độ plasmid được quy đổiMẫu bệnh phẩm: 27 mẫu bệnh lâm sàng từ đơn vị ng/µl sang copy/µl. Plasmid tái tổnghi nhiễm B. pseudomallei (nước tiểu, hợp chứa gen TTSS1-orf11 được pha loãngmáu, dịch rửa phế quản) và 5 mẫu máu của theo dải nồng độ 109-10-1 copy/µl trong nướcngười khỏe mạnh hiến máu tình nguyện. khử ion để tạo bộ mẫu chuẩn- sử dụng trongDNA tổng số vi khuẩn được tách theo quy thiết lập, tối ưu phản ứng real-time PCR,trình của nhà sản xuất (GeneJET Genomic đánh giá ngưỡng phát hiện (LOD) cũng nhưDNA Purification Kit/ GeneJET Whole độ chính xác.Blood Genomic DNA Purification Mi ...