Phương pháp xác định trình tự của acid nucleic

Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cậptrong các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acidnucleic nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bảnchất của nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì,có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thôngtin này chỉ có thể rút ra được từ việc xác định trình tựnucleotide của acid nucleic.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phương pháp xác định trình tự của acid nucleic CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰCỦA acid nucleic Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cậptrong các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acidnucleic nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bảnchất của nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì,có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thôngtin này chỉ có thể rút ra được từ việc xác định trình tựnucleotide của acid nucleic. Hai phương pháp xác định trình tự chính là phươngpháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phươngpháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Dù rấtkhác nhâu về nguyên tắc hai phương pháp này đều có mộtsố điểm chung : hình thành một tập hợp nhiềuoligonucleotide có chiều dài khác nhau, mỗi olygonucleotidecó sác xuất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trìnhtự này sau đó được phân tách dựa vào kích thước bằngphương pháp điện di trên gel polyacrylamide có khả năngphân tách hai trình tự chỉ cách nhau một nucleotide. Kết quảđọc được trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ một máy dò tựđộng. I-Nguyên tắc hóa học : Phương pháp Macxam và Gilbert. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADNcần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Trước hết phân tử ADN được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sauđó, chúng được chia thành 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lýhóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loạinucleotide và sau đó cắt phân tử AND ngay tại nnucleotide ấy. Nămnhóm nucleotide bị tạc động là : G, A, C , G + A , T + C. Kết quả củasự xử lý hóa học lả sự hình thành nên năm tập hợp olygonucleotide,các olygonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưnglại cung chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng năm phânđoạn trên được đen đi phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí của cácoligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và đượcphát hiện nhờ đầu đánh phóng xạ. Kết quả được đọc trên bảng phóngxạ tự ghi II-Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng cácdideoxynucleotide của Sanger Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerasemạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc trương củaphương pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốnloại dideoxynucleotide là những loại deoxynucleotide trong đó nhóm 3′OHđược thay bằng H. Điều này khiến các didoxynucleotide không còn khả nănghình thành các nối phosphatdiester và do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Trình tự ADN cần được xác dịnh phải được tạo dòng trong một vectermạch đơn (phage M 13). ADN polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenowcủa ADN polymerase I, Taq polymerase hay Sequanase. Sự tổng hợp mạchmới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M 13,với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấuđồng vị phóng xạ (35S). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phânđoạn riêng. Người ta lần lượt cho vào mỗi phân doạn một trong bốn loạidideoxynucleotide với hàn lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảngmới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp mộtoligonucleotide; và lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngùng lại. Tính xácsuất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các cỡ oligonucleotide ứng vớitất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên ADN. VD : nếu trình tự DNA cầnxác định là AATCGATAGGCTTGCATG thì trong phân đoạn có mặtdideoxynucleotide ddC sẽ có sự tổng hợp các oligonucleotide sau: AATC AATCGATGGC AATCGATGGCTTGC Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được đem phân tách trên gelpolyacrylmide và kết quả dược đọc trên bản phóng xạ tự ghi. III-Các phương pháp cải biên từ phươngpháp của Sanger Trong thực nghiệm, việc sử dụng phươngpháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phứctạo vì phải tạo dòng trở lại đoạn DNA cần xác địnhtrình tự vào một vecter mạch đơn (phage 13). Dođó, để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạodòng với vecter là các plasmid thế hệ thứ ba. Ở haibên của đoạn DNA được tạo dòng, các plasmidnày có mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi trình tựnằm trên một mặt. khi cần xác định trình tự củamạch nào, trước hết người ta tách rời hai mạch(biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp vớitrình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. Phản ứngtổng hợp xảy ra thoe nguyên tắc đã nêu ở phầntrên. 1-Xác định trình tự bằng máy tự động Trong kỹ thuật này, người ta không đánh dấubằng đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất –cácfluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánhdấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Nhưvậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tạimột loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu.Sau khi điện di trên gel polyacryl amide, kết quả sẽđược đọc qua một hệ thống vi tính. Tất cả các phương pháp vừa kể đều dùng đểxác định trình tự của một DNA đã được tạo dòng.Sự ra đời của phương pháp PCR cho phép xácđịnh trực tiếp trình tự của một DNA khuyếch đạibằng PCR không qua tạo dòng. 2-Phương pháp PCR dùng trong xác địnhtrình tự nucleic acid Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sựphối hợp giữa phương pháp PCR và phương phápsử dụng các dideoxynucleotide.Phương pháp chỉsử dụng được khi vùng cần xác định trình tư đãbiết trước ; và ứng dụng chủ yếu là dùng phát hiệnnhah một đột biến điểm. Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tựđược khuyếch đại bằng phương pháp PCR. Sauđó, hai mạch của phân tử DNA được tách rời nhau.Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi (có thể là mồidùng cho phản ứng PCR hay một mồi nằm bêntrong đoạn DNA). Phản ứng tổng hợp xảy ra tượngtự như trong các phương pháp enzyme học sửdụng dideoxynucleotide. *************************************** Tóm tắt Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid đều dựa vào hainguyên tắc : -Nguyên tắc hóa học (phương pháp Macxam-Gilbert): dựa vàocác phản ứng hóa học thủy giải đặ c hiệu DNA, tạo thành một tập ...