Polymerase, PCR là gì?

DNA polymerase (ADN polymeraza) là một enzyme tham gia chính vào quá trình nhân đôi DNA. Những enzyme này xúc tác cho quá trình polymer hóa các deoxiribonucleotide dựa trên trình tự của một chuỗi DNA khác. Sợi DNA mới được tạo thành sẽ bổ sung với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung.KỸ THUẬT PCR (Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi polymerase)PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợpcũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Polymerase, PCR là gì? Polymerase, PCR là gì?DNA polymerase (ADN polymeraza) là một enzyme tham gia chính vào quá trìnhnhân đôi DNA. Những enzyme này xúc tác cho quá trình polymer hóa cácdeoxiribonucleotide d ựa trên trình tự của một chuỗi DNA khác. Sợi DNA mớiđược tạo thành sẽ bổ sung với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung.KỸ THUẬT PCR (Polymerase chain reaction -Phản ứng chuỗi polymerase)PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vàisách là Phản ứng chuỗi trùng hợpcũng có sách gọi là phản ứng khuếch đại gen.PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ranhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống nh ư E.coli hay nấm men.PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mụcđích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán nhữngbệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.Quá trình phát hiện kỹ thuật PCRVào một buổi tối cuối tuần của tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe tr ên đườngở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng loé lên trong đầu của Kary Mulliskhi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏihai làn bánh xe cũ: « Dùng nhiệt độ tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn ». Lúcđó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học bình thường, đang làm việc trong mộtphòng thí nghiệm nhỏ.Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗipolymerase) vào năm 1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoahọc. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phátminh này.PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần.Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trìnhPCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair =kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo vớiDNA bổ sung ... gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kíchthuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote– ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base.Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đólà: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), đểxác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo vềmồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho vi ệc nhân lên của DNA. - Nucleotides(ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dungdịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerasePhản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làmnguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừasự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đunnóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu(natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500USD.RT - PCRVirus không có các ADN nên cần có một giai đoạn tạo các ADN bổ sung từ cácARN. Để làm được điều này ta dùng các enzyme sao chép ngược gọi làTranscriptase inverse (Retrotranscriptase ). RT – PCR (Reverse transcription -PCR) là phương pháp để phát hiện các ARN của virus.Hiện nay các phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam đang phát triển cácphương pháp mới: Real Time RT-PCR, Multiplex PCR,…PCR có thể tiến hành ởcác phòng thí nghiệm thông thường còn RT-PCR thường chỉ được thực hiện tạicác phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ.Virus H5N1 trong các mẫu có tỉ lệ rất nhỏ do đó rất khó phát hiện, tuy nhiên nếudùng các phương pháp nuôi cấy rất nguy hiểm vì dễ gây phát tán virus. Hiện nayđể phát hiện virus H5N1 trong mẫu cần khoảng 5-7 tiếng. Các nghiên cứu hiệnnay đa số tìm cách giảm thời gian này.Một phương pháp cải tiến là dùng một số đoạn ADN mồi đặc hiệu:Ví dụ các đoạn mồi đặc hiệu của Enders K.O. Ng, Peter K.C. Cheng,Antia Y.Y.Ng, T.L. Hoang, Wilina W.L. Lim ...