Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng

PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng Realtime PCRNguyên tắc và ứng dụng TS. BS. Đỗ Thị Thanh ThủyPCR PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection)2. Độ đặc hiệu kém3. Độ nhạy thấp4. Độ phân giải kém4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung th ư) REALTIME PCR→ Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time). Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang.REALTIME PCR HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc phát sáng Kính lọc kích thíchNguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogenDetector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 11 Cycle 13 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 1 10 102 103 104 105 106Cycle 11Cycle 13Cycle 15Cycle 19Cycle 23Cycle 26Cycle 29 C.41Cycle 31 C.39 Mẫu chưa biết [C]Cycle 33 C.36Cycle 34 Standard curve C.34Cycle 36 C.33Cycle 39 C.31Cycle 41 C.29 1 10 102 103 104 105 106PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆUThreshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnhquang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản ph ẩmPCR > tín hiệu nền.- Ct (Threshold cycle):là số chu kỳ mà tại đótín hiệu huỳnh quangcủa sản phẩm khuếchđại vượt qua ngưỡng.-Động học RealtimePCRPhân tích tiến trình phảnứng trong mỗi chu kỳnhiệt nhờ computerREALTIME PCR REALTIME PCR Log viewRael time PCR địnhlượng số copies tronggiai đoạn tăng lũy thừa TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG REAL TIME PCR Primers1. Chất nhuộm khi chèn vào sợi Taq polymeraseđôi DNA sẽ phát huỳnh quang: dNTP PCR buffer ♦ Ethidium bromide MgCl2 ♦ SYBR green 1 Chất phát huỳnh quang2. Probe đặc hiệu có gắn chất Target DNA (Template)phát huỳnh quang ♦ Taqman probe. ♦ Molecular Beacon Real-time PCR MIX ♦ Hybridization probe… Real-time PCR mix SYBR GREEN I Huỳnh quangkhông Không phát huỳnh quangSYBR SYBRGREEN I GREEN I SYBR GREEN IDNA caàn tìm DNA khoâng caàn tìm Khoâng phaân bieät ñöôïc saûn phaåm ñaëc hieäu hay SYBR GREEN ITínhđặchiệukhôngcao.TầmsoátsảnphẩmtrướckhisửdụngprobeđặchiệuThựchiệnkhiPCRđãđượctốiưuhóa,khôngcóprimerdimer,khôngcóampliconkhôngđặchiệu PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve)Mục đích: phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khu ếch đạiMelting temperature (Tm) của dsDNA: –To tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn –Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotideThực hiện:tăng To, DNA tách nhau ra,Đưa To về 55oC. Tăng dầnnhiệt độ, chụp hình tín hiệuhuỳnh quang mỗi 0,5oC.Melting Curve PHÂN BIỆTSẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve)REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE 1. ƯU ĐIỂM Probe đặc hiệu Multiplex PCR 2. NHƯỢC ĐIỂM Giá thành cao ...