Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN

Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắc thể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADNHầu hết các phân tử ADN trong tự nhiênđều lớn hơn nhiều so với kích thước cóthể thao tác và phân tích một cách thuậnlợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tếbào, phần lớn các nhiễm sắc thể thườnglà một phân tử ADN dài chứa hàng trămthậm trí hàng nghìn gen khác nhau.Vì vậy, để có thể phân lập và phân tíchtừng gen, người ta phải cắt các phân tửADN kích thước lớn thành các phânđoạn nhỏ. Công việc này được thựchiện bởi một nhóm các enzym đặc biệtgọi là enzym giới hạn.Tất cả các enzym giới hạn đều có haiđặc tính: 1) nhận biết một trình tự đặchiệu trên phân tử ADN (gọi là trình tựgiới hạn); và 2) cắt bên trong phân tửADN tại vị trí đặc hiệu (hoặc ngay tạivị trí giới hạn như đối với nhóm enzymgiới hạn loại ; hoặc cách vị trí giới hạnmột số nucleotit nhất định như đối vớicác nhóm enzym giới hạn thuộc cácnhóm và ). Trong các nhóm enzym giớihạn, nhóm thường được dùng trong cácnghiên cứu di truyền phân tử và kỹ nghệgen là nhóm nhờ vị trí và trình tự cắt củachúng được xác định rõ. Vì vậy chúng tachỉ đề cập đến việc ứng dụng của nhómenzym giới hạn này. Các trình tự giớihạn của enzym nhóm thường gồm 4 - 8bp, thông thường có tính đối xứng và vịtrí cắt thường nằm trong trình tự giớihạn này. Ví dụ như enzym giới hạn coRđược tìm thấy ở vi khuẩn E. coli có trìnhtự giới hạn là 5’-GAATTC- 3’ với vị trícắt ở giữa G và A. Tên enzym gồm 3 kýtự đầu chỉ tên loài vi khuẩn mà từ đóenzym được tìm thấy (Eco = Escherichiacoli), các ký tự sau chỉ tên của chủng vikhuẩn và số thứ tự của enzym được tìmthấy ở loài vi khuẩn đó (EcoRI là enzymgiới hạn đầu tiên được tìm thấy ở E.coli).Một enzym giới hạn có trình tự giới hạngồm 6 bp giống EcoRI thông thườngđược trông đợi sẽ có trung bình một vịtrí cắt trong một đoạn trình tự có kíchthước khoảng 4 kb (bởi theo nguyên tắcxác suất tại một vị trí nhất định xác suấtđể có một loại nucleotit nhất định là 1/4,vì vậy xác suất để có một trình tự nhấtđịnh gồm 6 bp sẽ là 1/46 = 1/4096). Giảsử có một phân tử ADN mạch thẳng có6 vị trí cắt của enzym EcoRI. Việc cắtphân tử ADN này bằng EcoRI sẽ cho ra7 phân đoạn ADN khác nhau. Do đó, khiđiện di trên gel sản phẩm cắt, 7 phânđoạn ADN sẽ phân tách nhau ra dochúng khác nhau về khối lượng (vìchúng khác nhau về thành phần và trìnhtự các nucleotit). Như vậy, một phânđoạn ADN sẽ tương ứng với một vùngcủa phân tử ADN ban đầu.Việc sử dụng một enzym giới hạn khác,chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giớihạn gồm 6 bp, nhưng có trình tự giớihạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) sẽ cho racác sản phẩm cắt khác với khi sử dụngEcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu).Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiềuenzym giới hạn sẽ tạo ra một kiểu hìnhphổ điện di các phân đoạn cắt giới hạnđặc thù đối với từng gen phân tích.Đối với một số enzym giới hạn khác,chẳng hạn như Sau3A1 (tìm thấy ở vikhuẩn Staphylococcus aureus) có trình tựgiới hạn ngắn hơn (5’-GATC-3’), nêntần số cắt của chúng thường cao hơncác enzym có trình tự giới hạn dài. Theoxác suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trícắt trong một đoạn trình tự khoảng 250bp (1/44 = 1/256). Ngược lại, enzymNotI có trình tự giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình cứ mộtđoạn trình tự dài khoảng 65 kb, mới có 1vị trí cắt (1/48 = 1/65536).Các enzym giới hạn không chỉ khác nhauvề trình tự giới hạn và độ dài đoạn trìnhtự giới hạn đặc trưng của chúng, màchúng còn khác nhau về cách “cắt” phântử ADN. Chẳng hạn như enzym HpaItạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng(đầu tù), còn các enzym RcoRI, HindIIIvà PsIt cắt phân tử ADN tạo ra các phânđoạn có đầu dính. Sở dĩ gọi là “đầudính” bởi phần các trình tự ở hai đầu saukhi được enzym cắt ra bổ trợ với nhautheo nguyên tắc Chargaff và vì vậychúng có xu hướng “dính” trở lại vớinhau, hoặc với các phân tử ADN đượccắt bởi cùng một loại enzym giới hạn.Tính chất này được ứng dụng rộng rãitrong công nghệ ADN tái tổ hợp và cáckỹ thuật tách dòng phân tử. ...